脐带华通胶源间充质干细胞向心肌细胞分化潜能的研究

发布时间：2017-04-18 21:00

  本文关键词：脐带华通胶源间充质干细胞向心肌细胞分化潜能的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:通过脐带华通胶源间充质干细胞在体外诱导和体内移植观察其向心肌细胞分化的特性,选择心肌重建新的优良种子细胞,并在体内外分子、细胞、整体水平上,确证华通胶源间充质干细胞向心肌分化潜能,为华通胶源间充质干细胞修复重建心肌临床研究奠定理论基础。方法:提取脐带华通胶,将华通胶剪成细小的组织块,使用贴壁法分离间充质干细胞,组织块贴壁培养12-14天细胞融合为原代细胞,当细胞贴壁生长达到80-90%融合时传代培养。取第二代生长良好的细胞进行流式检测表面标记CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC、CD34、CD45、HLA-DR。使用四甲基偶氮唑盐(MTT)法进行细胞增殖特性检测,取生长良好的第2代WJMSCs进行成骨、成脂肪、成软骨分化鉴定。心肌特异分化基因表达特征检测,应用QT-PCR定量检测WJMSCs心肌早期特异转录因子Isl-1、flk-1、Nkx2.5表达水平;在5-氮胞苷诱导下向心肌细胞分化和心肌细胞特异标志α-actin、Tn T、GATA-4、connexin-43检测。制作大鼠心肌梗死模型,在模型建立14天后在体内进行WJMSCs移植,移植量为0.5ml计2×106细胞,心梗大鼠移植WJMSCs一个月,行超声心动图检测,观察心功能的变化;免疫荧光共聚焦、m RNA水平、蛋白水平进行心肌细胞特异标志α-actin、Tn T、GATA-4、connexin-43检测。结果:脐带华通胶经组织块贴壁法培养,6天WJMSCs从组织块中爬出,呈梭型贴壁生长,12-14天WJMSCs在组织块周围生长并接近融合,经传代后24h,细胞进入对数生长期,6天后,细胞进入平台生长期,增殖减慢,8天后细胞进入衰亡期,取2代生长良好的WJMSCs进行流式细胞仪检测表面标志,WJMSCs表达CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC,不表达CD34、CD45、及HLA-DR,符合间充质干细胞的特性。WJMSCs在成骨、成脂肪、成软骨诱导培养基中培养2周后,细胞碱性磷酸酶、茜素红、油红“O”、亚甲蓝染色呈阳性反应,表明WJMSCs可向成骨、成脂肪、成软骨细胞分化。QT-PCR定量检测WJMSCs表达心肌早期特异转录因子flk-1、Isl-1、Nkx2.5;WJMSCs在5-氮胞苷诱导下可以向心肌样细胞分化,表达心肌细胞特异标志α-actin,Tn T,GATA-4,connexin-43。大鼠经开胸结扎前降支,结扎后出现大面积心肌表面变苍白、且伴有室壁运动紊乱或减弱,心电图检查可见两个或两个以上相邻导联Q波形成且1/4R波,宽度0.04 s,左室射血分数≤45%,大鼠心肌梗死模型制作成功;细胞移植后进行超声心动图检查,移植组LVEF治疗后(61.62±8.74%)较治疗前(43.02±3.67%)及对照组治疗后(43.43±4.2%)相比均显著增高(P0.01);LAVW移植组LAVW治疗后(1.84±0.36 mm)较治疗前(1.28±0.45 mm)及对照组治疗后(1.21±0.31 mm)相比显著增高(P0.5);免疫荧光共聚焦、m RNA水平、蛋白水平进行心肌细胞特异标志α-actin、Tn T、GATA-4、connexin-43检测,WJMSCs移植组明显高于对照组。结论:研究表明WJMSCs在体外培养具有多向分化的潜能,具有心肌细胞早期转录因子,经5-氮胞苷诱导可向心肌细胞分化,表达心肌细胞所特有的细胞表面标志,证实WJMSCs在体外可以向心肌细胞分化;WJMSCs在体外移植到心肌梗死大鼠体内后,可明显改善大鼠心功能,病理检查心肌特异标志物明显高于对照组,在实验大鼠心梗模型上证实了WJMSCs在体内可以向心肌细胞分化。
【关键词】：华通胶间充质干细胞 大鼠 心肌梗死 心肌细胞 分化
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩略词11-13
• 第1章 前言13-20
• 1.1 干细胞研究概述和干细胞培养技术14-16
• 1.1.1 胚胎干细胞（ESCs）：14-15
• 1.1.2 骨髓间充质干细胞(BMMSCs)：15
• 1.1.3 脐血及脐带华通胶间充质干细胞：15
• 1.1.4 i PS细胞：15-16
• 1.2 用于心血管疾病治疗的干细胞研究16-17
• 1.2.1 骨髓单个核细胞（BMMCs）：16
• 1.2.2 骨骼肌干细胞：16
• 1.2.3 骨髓间充质干细胞（BMMSCs）：16
• 1.2.4 胚胎干细胞(ESCs)：16-17
• 1.2.5 同种异体间充质干细胞：17
• 1.2.6 羊水干细胞：17
• 1.2.7 脐带华通胶源间充质干细胞（WJMSCs）：17
• 1.3 缺血性心肌病的治疗现状17-18
• 1.4 缺血性心肌病的细胞学治疗现状与趋势18-20
• 第2章 材料与方法20-34
• 2.1 实验材料20-24
• 2.1.1 脐带来源20
• 2.1.2 大鼠来源20
• 2.1.3 主要试剂20-22
• 2.1.4 主要仪器及设备22
• 2.1.5 配置试剂22-24
• 2.2 研究方法24-33
• 2.2.1 体外细胞的培养鉴定分化24-31
• 2.2.2 体内WJMSCs向心肌细胞分化的研究31-33
• 2.3 统计学处理33-34
• 第3章 结果34-42
• 3.1 WJMSCs生长特点34-35
• 3.2 WJMSCs表面标记物的检测35-36
• 3.3 WJMSCs成骨、成脂肪、成软骨的诱导分化36-37
• 3.4 心肌早期特异转录因子ISl-1、flk-1、Nkx2.5 表达37
• 3.5 免疫荧光检测心肌特异标记物37-38
• 3.6 大鼠心肌梗死模型的制备和细胞移植38
• 3.7 WJMSCs移植对大鼠心功能影响38-39
• 3.8 WJMSCs移植后免疫荧光共聚焦检测大鼠心肌细胞特异标志39-40
• 3.9 WJMSCs移植后mRNA水平检测心肌特异性标志物40-41
• 3.10 WJMSCs移植后蛋白水平检测心肌特异性标志物41-42
• 第4章 结论42-43
• 第5章 讨论43-48
• 参考文献48-55
• 作者简介及在读硕士期间取得的科研成果55-58
• 致谢58

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