金黄色葡萄球菌噬菌体80αSak结构生物学研究和光修复酶phr相关蛋白表达纯化
发布时间：2021-05-27 09:51
第一部分:金黄色葡萄球菌噬菌体80α Sak的结构生物学研究Sak蛋白最早是在乳酸链球菌噬菌体u136中鉴定并命名的,与其它噬菌体来源的重组酶构成Sak家族。u136 Sak是目前唯一得到结构解析的Sak家族蛋白,电镜负染结构表明其为11聚体圆环状结构,与人源Rad52蛋白N端结构域类似,被认为是Rad52的早期进化源蛋白之一。根据序列、结构或功能上的相似性,Sak家族被划为Rad52-like超家族,Sak家族蛋白的相关研究,有利于揭示Rad52类似蛋白的作用机制。金黄色葡萄球菌是一种人类致病菌,最近在金黄色葡萄球菌噬菌体80α基因组复制研究中,鉴定得到80α Sak蛋白,根据序列和功能上的相似性,该蛋白被划入Sak家族,并且与人源Rad52端N结构域在体外功能上类似,可能是人源Rad52蛋白的同源蛋白。Rad52是双链DNA断裂（DSB）修复的核心蛋白之一,可以以Rad51依赖型和Rad51非依赖型两种方式参与DSB的同源重组修复。为阐明Rad52的具体作用机制,人源Rad52 N端及其与核酸复合物的晶体结构得到解析。研究结果显示,Rad52在溶液状态下,呈11聚体环状结构,内部疏...
【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一篇 金黄色葡萄球菌噬菌体80α Sak结构生物学研究
第1章 综述
1.1 金黄色葡萄球菌噬菌体80α Sak蛋白的发现
1.2 Sak家族蛋白简介
1.2.1 Sak家族划分
1.2.2 Sak家族蛋白研究现状
1.3 DNA双链断裂修复
1.4 Rad52蛋白参与同源重组的机制研究
1.5 本篇拟解决问题
第2章 实验材料与方法
2.1 基因克隆及质粒构建
2.1.1 基因克隆
2.1.2 PCR产物回收
2.1.3 酶切和连接
2.1.4 感受态细胞制备
2.1.5 连接子转化及扩增
2.1.6 阳性克隆鉴定
2.2 重组蛋白的表达纯化
2.2.1 80α Sak蛋白的表达
2.2.2 80α Sak蛋白的纯化
2.3 80α Sak的进化分析及结构预测
2.4 80α Sak蛋白活性检测
2.4.1 等温滴定量热实验
2.4.2 80α Sak蛋白单链退火活性检测
2.5 电镜观察与数据收集
2.5.1 负染样品的制备
2.5.2 冷冻样品的制备
2.5.3 冷冻样品的数据收集
2.5.4 图像处理及模型构建
2.6 80α Sak蛋白颗粒大小及聚集状态检测
2.6.1 动态光散射(DLS)实验
2.6.2 静态光散射(SLS)实验
2.6.3 S200分子筛标定实验
2.7 80α Sak蛋白与ssDNA复合物的负染观察
第3章 实验结果与讨论
3.1 基因克隆和重组质粒构建
3.2 重组蛋白的表达鉴定和分离纯化
3.3 80α Sak蛋白与Rad52相关蛋白进化关系分析
3.4 80 αSak与人源Rad52的结构比对与活性鉴定
3.4.1 80α Sak与人源Rad52的结构比对
3.4.2 80α Sak的活性鉴定
3.5 80αSak蛋白单颗粒负染样品制备及结果分析
3.6 80α Sak单颗粒冷冻电镜数据处理及结果分析
3.7 80αSak聚集状态的生化表征
3.8 80α Sak与单链DNA复合物负染分析
本篇小结
参考文献
第二篇 光修复酶phr相关蛋白表达纯化
第4章 综述
4.1 DNA光损伤简介
4.2 DNA光损伤修复途径简介
4.3 光修复酶简介
4.4 DNA光损伤防护措施
4.5 本篇拟解决问题
第5章 实验材料与方法
5.1 基因克隆及质粒构建
5.1.1 基因克隆
5.1.2 PCR产物回收及Gibson连接
5.1.3 连接子转化及扩增
5.1.4 阳性克隆鉴定
5.2 重组蛋白的表达纯化
5.2.1 重组蛋白的表达
5.2.2 重组蛋白的纯化
5.3 钝顶螺旋藻光修复酶phr的单/双链嘧啶二聚体修复活性测定
第6章 实验结果与讨论
6.1 基因克隆和重组质粒构建
6.2 重组蛋白的表达鉴定和分离纯化
6.3 钝顶螺旋藻光修复酶phr的单/双链嘧啶二聚体修复活性测定
本篇小结
参考文献
附录
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果
本文编号：3207357
【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一篇 金黄色葡萄球菌噬菌体80α Sak结构生物学研究
第1章 综述
1.1 金黄色葡萄球菌噬菌体80α Sak蛋白的发现
1.2 Sak家族蛋白简介
1.2.1 Sak家族划分
1.2.2 Sak家族蛋白研究现状
1.3 DNA双链断裂修复
1.4 Rad52蛋白参与同源重组的机制研究
1.5 本篇拟解决问题
第2章 实验材料与方法
2.1 基因克隆及质粒构建
2.1.1 基因克隆
2.1.2 PCR产物回收
2.1.3 酶切和连接
2.1.4 感受态细胞制备
2.1.5 连接子转化及扩增
2.1.6 阳性克隆鉴定
2.2 重组蛋白的表达纯化
2.2.1 80α Sak蛋白的表达
2.2.2 80α Sak蛋白的纯化
2.3 80α Sak的进化分析及结构预测
2.4 80α Sak蛋白活性检测
2.4.1 等温滴定量热实验
2.4.2 80α Sak蛋白单链退火活性检测
2.5 电镜观察与数据收集
2.5.1 负染样品的制备
2.5.2 冷冻样品的制备
2.5.3 冷冻样品的数据收集
2.5.4 图像处理及模型构建
2.6 80α Sak蛋白颗粒大小及聚集状态检测
2.6.1 动态光散射(DLS)实验
2.6.2 静态光散射(SLS)实验
2.6.3 S200分子筛标定实验
2.7 80α Sak蛋白与ssDNA复合物的负染观察
第3章 实验结果与讨论
3.1 基因克隆和重组质粒构建
3.2 重组蛋白的表达鉴定和分离纯化
3.3 80α Sak蛋白与Rad52相关蛋白进化关系分析
3.4 80 αSak与人源Rad52的结构比对与活性鉴定
3.4.1 80α Sak与人源Rad52的结构比对
3.4.2 80α Sak的活性鉴定
3.5 80αSak蛋白单颗粒负染样品制备及结果分析
3.6 80α Sak单颗粒冷冻电镜数据处理及结果分析
3.7 80αSak聚集状态的生化表征
3.8 80α Sak与单链DNA复合物负染分析
本篇小结
参考文献
第二篇 光修复酶phr相关蛋白表达纯化
第4章 综述
4.1 DNA光损伤简介
4.2 DNA光损伤修复途径简介
4.3 光修复酶简介
4.4 DNA光损伤防护措施
4.5 本篇拟解决问题
第5章 实验材料与方法
5.1 基因克隆及质粒构建
5.1.1 基因克隆
5.1.2 PCR产物回收及Gibson连接
5.1.3 连接子转化及扩增
5.1.4 阳性克隆鉴定
5.2 重组蛋白的表达纯化
5.2.1 重组蛋白的表达
5.2.2 重组蛋白的纯化
5.3 钝顶螺旋藻光修复酶phr的单/双链嘧啶二聚体修复活性测定
第6章 实验结果与讨论
6.1 基因克隆和重组质粒构建
6.2 重组蛋白的表达鉴定和分离纯化
6.3 钝顶螺旋藻光修复酶phr的单/双链嘧啶二聚体修复活性测定
本篇小结
参考文献
附录
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果
本文编号：3207357
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