基于重组酶介导核酸等温扩增反应的曼氏血吸虫基因检测方法的建立
发布时间：2021-06-10 18:40
目的建立一种可用于曼氏血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法（Recombinase-aided amplification,RAA）。方法以曼氏血吸虫121 bp高重复基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计、合成引物及荧光探针,建立并优化荧光RAA法反应体系。分别以不同拷贝数的含121 bp基因片段的重组质粒及不同浓度曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA法扩增,评价该方法的敏感性;分别以日本和埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,评价其特异性。结果建立的荧光RAA法可在39℃、20 min内特异性扩增曼氏血吸虫基因组DNA。以重组质粒为模板,荧光RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10拷贝/μL;以基因组DNA为模板,荧光RAA法最低可检测浓度为0.1 fg/μL。以日本血吸虫虫卵、埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,结果均为阴性。结论成功建立了一种可用于曼氏血吸虫DN A检测的荧光RAA法,该方法反应快捷、操作简便,敏感性和特异性均较好。
【文章来源】：中国血吸虫病防治杂志. 2020,32(04)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
以不同基因组DNA为模板的荧光RAA法特异性FigFig.5SpecificityoffluorescentRAAassayusingthegenomicDNNAfromvariousparasitesastemplatesA
rol;2ProductsofRAAamplificationofS.mansonigenomicDNAastemplate;MDNAmolecularmarker图1以曼氏血吸虫基因组DNA为模板的RAA扩增产物11.5%琼脂糖电泳Figig.111.5%agaroseelectrophoresisofproductsofRAAamplificationofSS.mansonigenomicDNAasatemplate2以曼氏血吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA反应以曼氏血吸虫成虫基因组DNA样本为模板进行荧光RAA扩增，在反应温度为39℃时，荧光信号在5min内即出现明显而快速上升，结果为阳性，阴性对照反应荧光信号则无明显上升（图2）。图2以曼氏血吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增FigFig.2FluorescentRAAamplificationofSS.mansonigenomicDNAusedasatemplate3荧光RAA法检测敏感性3.1以含曼氏血吸虫121bp重复序列的重组质粒为模板的敏感性以不同拷贝数的重组质粒为模板进行荧光RAA扩增，20min内所有样品均出现明显扩增。随着重组质粒拷贝数降低，检测到明显增加的荧··337
中国血吸虫病防治杂志2020年第32卷第4期ChinJSchistoControl2020，Vol.32，No.4光信号所需时间逐渐延长，最低可检测到含有10拷贝/μL重组质粒的荧光信号。阴性对照反应荧光信号无明显增加（图3）。3.2以不同浓度曼氏血吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA法敏感性以曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，0.1~1pg/μL不同浓度样本均有扩增且在20min前均可检测到，最低检出浓度可达到0.1fg/μL。阴性对照反应荧光信号无明显增加（图4）。图3以重组质粒为模板的荧光RAA法检测敏感性FigFig.3SensitivityoffluorescentRAAassaybyusingrecombinantplasmidsastemplates图4以不同不同浓度曼氏血吸虫DNA为模板的荧光RAA法敏感性FigFig.4SensitivityoffluorescentRAAassayusingSS.mansonigenomicDNAatdifferentconcentrationsastemplates4荧光RAA法检测特异性分别以曼氏血吸虫成虫DNA以及日本血吸虫虫卵、埃及血吸虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴和十二指肠钩虫虫卵DNA为模板进行荧光RAA扩增，仅以曼氏血吸虫成虫DNA为模板的RAA反应在10min内检测到明显增加的荧光信号，结果为阳性。其他样本反应的荧光信号均未检测到明显增加，结果为阴性（图5）。图5以不同基因组DNA为模板的荧光RAA法特异性FigFig.5SpecificityoffluorescentRAAassayusingthegenomicDNNAfromvariousparasitesastemplatesA讨论我国是日本血吸虫病流行区，经过多年积极防控，血吸虫病防治工作取得了举世瞩目的巨大成就，血吸虫病疫情已处于历史较低水平［17］，但对境外输入性曼氏、埃及、间插血吸虫病和湄公血吸虫病研究甚少
【参考文献】：
期刊论文
[1]2018年全国血吸虫病疫情通报[J]. 张利娟,徐志敏,郭婧怡,戴思敏,党辉,吕山,许静,李石柱,周晓农. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(06)
[2]输入性曼氏血吸虫病监测与防控对策专家共识[J]. 周晓农,李石柱,许静,陈家旭,闻礼永,张仁利,吕超. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(06)
[3]重组酶介导的隐孢子虫属特异性等温核酸扩增方法的建立及评价[J]. 倪碧娴,吴小珉,刘燕红,徐祥珍,应清界,曹俊,戴洋. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(04)
[4]重组酶介导的核酸等温扩增荧光法快速检测日本血吸虫感染性钉螺[J]. 李婷,刘燕红,赵松,熊春蓉,董萱,张键锋,李伟,应清界,杨坤. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(02)
[5]境外血吸虫病输入我国的现状及面临风险[J]. 张剑锋,闻礼永,许静,梁幼生,严晓岚,任光辉,贾铁武,汪伟,周晓农. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(01)
[6]重组酶介导的日本血吸虫特异性基因片段核酸等温扩增检测方法的建立[J]. 赵松,李婷,杨坤,李伟,张键锋,郭利川,刘燕红,戴洋,应清界,羊海涛. 中国血吸虫病防治杂志. 2018(03)
[7]北京市6例输入性曼氏血吸虫病临床特点分析[J]. 邹洋,王磊,李小丽,田小军,李威,安亦君,齐志群,李晶晶,王非,黄敏君. 中国血吸虫病防治杂志. 2017(02)
[8]深圳市大沙河、观澜河藁杆双脐螺分布及其生态环境调查[J]. 高世同,李晓恒,黄少玉,谢旭,梅树江,阮彩文,黄达娜. 中国热带医学. 2013(03)
[9]184例疑似输入性埃及血吸虫病病例回顾性调查[J]. 易平,袁里平,王璋华,何永康,荆群山,周杰,王洪波,李胜明,Franziska Bieri. 中国血吸虫病防治杂志. 2011(04)
[10]输入性曼氏血吸虫病临床分析[J]. 邹洋,齐志群,冯曼玲,王非,李威,栗绍刚,许炽熛,谷俊朝. 中国热带医学. 2011(02)
本文编号：3222917
【文章来源】：中国血吸虫病防治杂志. 2020,32(04)北大核心CSCD
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【部分图文】：
以不同基因组DNA为模板的荧光RAA法特异性FigFig.5SpecificityoffluorescentRAAassayusingthegenomicDNNAfromvariousparasitesastemplatesA
rol;2ProductsofRAAamplificationofS.mansonigenomicDNAastemplate;MDNAmolecularmarker图1以曼氏血吸虫基因组DNA为模板的RAA扩增产物11.5%琼脂糖电泳Figig.111.5%agaroseelectrophoresisofproductsofRAAamplificationofSS.mansonigenomicDNAasatemplate2以曼氏血吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA反应以曼氏血吸虫成虫基因组DNA样本为模板进行荧光RAA扩增，在反应温度为39℃时，荧光信号在5min内即出现明显而快速上升，结果为阳性，阴性对照反应荧光信号则无明显上升（图2）。图2以曼氏血吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增FigFig.2FluorescentRAAamplificationofSS.mansonigenomicDNAusedasatemplate3荧光RAA法检测敏感性3.1以含曼氏血吸虫121bp重复序列的重组质粒为模板的敏感性以不同拷贝数的重组质粒为模板进行荧光RAA扩增，20min内所有样品均出现明显扩增。随着重组质粒拷贝数降低，检测到明显增加的荧··337
中国血吸虫病防治杂志2020年第32卷第4期ChinJSchistoControl2020，Vol.32，No.4光信号所需时间逐渐延长，最低可检测到含有10拷贝/μL重组质粒的荧光信号。阴性对照反应荧光信号无明显增加（图3）。3.2以不同浓度曼氏血吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA法敏感性以曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，0.1~1pg/μL不同浓度样本均有扩增且在20min前均可检测到，最低检出浓度可达到0.1fg/μL。阴性对照反应荧光信号无明显增加（图4）。图3以重组质粒为模板的荧光RAA法检测敏感性FigFig.3SensitivityoffluorescentRAAassaybyusingrecombinantplasmidsastemplates图4以不同不同浓度曼氏血吸虫DNA为模板的荧光RAA法敏感性FigFig.4SensitivityoffluorescentRAAassayusingSS.mansonigenomicDNAatdifferentconcentrationsastemplates4荧光RAA法检测特异性分别以曼氏血吸虫成虫DNA以及日本血吸虫虫卵、埃及血吸虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴和十二指肠钩虫虫卵DNA为模板进行荧光RAA扩增，仅以曼氏血吸虫成虫DNA为模板的RAA反应在10min内检测到明显增加的荧光信号，结果为阳性。其他样本反应的荧光信号均未检测到明显增加，结果为阴性（图5）。图5以不同基因组DNA为模板的荧光RAA法特异性FigFig.5SpecificityoffluorescentRAAassayusingthegenomicDNNAfromvariousparasitesastemplatesA讨论我国是日本血吸虫病流行区，经过多年积极防控，血吸虫病防治工作取得了举世瞩目的巨大成就，血吸虫病疫情已处于历史较低水平［17］，但对境外输入性曼氏、埃及、间插血吸虫病和湄公血吸虫病研究甚少
【参考文献】：
期刊论文
[1]2018年全国血吸虫病疫情通报[J]. 张利娟,徐志敏,郭婧怡,戴思敏,党辉,吕山,许静,李石柱,周晓农. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(06)
[2]输入性曼氏血吸虫病监测与防控对策专家共识[J]. 周晓农,李石柱,许静,陈家旭,闻礼永,张仁利,吕超. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(06)
[3]重组酶介导的隐孢子虫属特异性等温核酸扩增方法的建立及评价[J]. 倪碧娴,吴小珉,刘燕红,徐祥珍,应清界,曹俊,戴洋. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(04)
[4]重组酶介导的核酸等温扩增荧光法快速检测日本血吸虫感染性钉螺[J]. 李婷,刘燕红,赵松,熊春蓉,董萱,张键锋,李伟,应清界,杨坤. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(02)
[5]境外血吸虫病输入我国的现状及面临风险[J]. 张剑锋,闻礼永,许静,梁幼生,严晓岚,任光辉,贾铁武,汪伟,周晓农. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(01)
[6]重组酶介导的日本血吸虫特异性基因片段核酸等温扩增检测方法的建立[J]. 赵松,李婷,杨坤,李伟,张键锋,郭利川,刘燕红,戴洋,应清界,羊海涛. 中国血吸虫病防治杂志. 2018(03)
[7]北京市6例输入性曼氏血吸虫病临床特点分析[J]. 邹洋,王磊,李小丽,田小军,李威,安亦君,齐志群,李晶晶,王非,黄敏君. 中国血吸虫病防治杂志. 2017(02)
[8]深圳市大沙河、观澜河藁杆双脐螺分布及其生态环境调查[J]. 高世同,李晓恒,黄少玉,谢旭,梅树江,阮彩文,黄达娜. 中国热带医学. 2013(03)
[9]184例疑似输入性埃及血吸虫病病例回顾性调查[J]. 易平,袁里平,王璋华,何永康,荆群山,周杰,王洪波,李胜明,Franziska Bieri. 中国血吸虫病防治杂志. 2011(04)
[10]输入性曼氏血吸虫病临床分析[J]. 邹洋,齐志群,冯曼玲,王非,李威,栗绍刚,许炽熛,谷俊朝. 中国热带医学. 2011(02)
本文编号：3222917
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