一种新型Ⅰ型成骨不全小鼠模型的构建及治疗
发布时间：2021-06-14 02:59
目的:成骨不全（osteogenesis imperfecta）是一种以骨脆性增加、骨结构异常为临床特征的遗传性疾病,目前临床治疗以手术矫正为主,但是多次手术给患者带来极大痛苦。在所有成骨不全分类中,Ⅰ型成骨不全发病率最高,由COL1A1基因单倍剂量不足导致Ⅰ型胶原蛋白含量降低引起。Ⅰ型胶原蛋白的改变会影响骨发育相关通路,但具体分子机制尚不明确。目前已有的小鼠模型Mov13虽然Ⅰ型胶原蛋白表达降低,但是与临床病人胶原蛋白水平降低的机制不同,同时该小鼠模型会出现表型减退的现象。因此,本研究拟采用CRISPR/Cas9技术构建从致病机制到表型更加接近Ⅰ型成骨不全的小鼠模型,研究Ⅰ型胶原蛋白降低影响小鼠骨形成的机制,并在此基础上寻找安全有效的治疗方法,为临床成骨不全治疗提供新的方法和思路。方法:（1）采用CRISPR/Cas9技术将小鼠col1a1基因25外显子敲除,构建Ⅰ型成骨不全小鼠模型;采用PCR及琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型进行鉴定,将Ⅰ型成骨不全小鼠命名为col1a1+/-365。（2）分别取col1a1+/-365小...
【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校
【文章页数】：132 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
小鼠Col1a1基因转录本分析
L1A1 基因发生突变导致。NCBI 数据库显示小鼠 Col1a1 基因包含 51 个外，起始密码子 ATG 在第 1 个外显子上，TAA 终止密码子在第 51 个外显子 有 四 个 转 录 本 （ Col1a1-201 ， Col1a1-202 ， Col1a1-203 ， Col1a1-2http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Splice?db=core;g=ENSMUSG000506;r=11:94936224-94953042）（图 1-1），只有 Col1a1-201 转录本可以翻译白质，因此以该转录本作为研究对象。I 型成骨不全小鼠 Col1a1 表达量降该想法与南京大学-南京生物医药研究院技术人员交流，经过协商，将 Co因 2~5 外显子作为 CRISPR/Cas9 作用的位点，如图 1-2 所示。小鼠模型构作由南京大学-南京生物医药研究院完成。图 1-1 小鼠 Col1a1 基因转录本分析
图 1-3 I 型成骨不全小鼠构建方案及基因型鉴定A. I 型成骨不全小鼠构建方案，蓝色十字代表 Cas9 核酸内切酶作用位点，绿框代表Col1a1 基因 2~5 外显子，绿框之间的直线表示内含子，F 和 R 表示 PCR 上下游引物位置；B. Col1a1 基因 2~5 外显子被敲除后氨基酸序列预测结果， wt 表示野生型小鼠，col1a1+/-365表示杂合小鼠；C. 琼脂糖凝胶电泳结果，M 表示 2 kb DNA marker，B 表示无 DNA 模板的空白对照，wt 表示野生型对照。1.2.2 col1a1+/-365小鼠基本特征col1a1+/-365小鼠以及同窝野生型小鼠见图 1-4A，从图中可以看出与同窝野生型小鼠相比，col1a1+/-365小鼠身形偏小。对其体重连续监测，结果如图 1-4B所示，与同窝相同周龄的野生型小鼠相比，col1a1+/-365小鼠体重更轻。将获得的col1a1+/-365小鼠互相交配，未得到 Col1a1 基因全部缺失的纯合小鼠，文献报道，Col1a1 基因编码的 I 型胶原蛋白遍布全身，Col1a1 基因全部敲除的纯合子小鼠会出现胚胎致死现象，因此本研究未得到 Col1a1 基因全部缺失的纯合小鼠可能由于胚胎致死造成[48]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Bone Remodeling and Energy Metabolism:New Perspectives[J]. Francisco J.A.de Paula,Clifford J.Rosen. Bone Research. 2013(01)
本文编号：3228921
【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校
【文章页数】：132 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
小鼠Col1a1基因转录本分析
L1A1 基因发生突变导致。NCBI 数据库显示小鼠 Col1a1 基因包含 51 个外，起始密码子 ATG 在第 1 个外显子上，TAA 终止密码子在第 51 个外显子 有 四 个 转 录 本 （ Col1a1-201 ， Col1a1-202 ， Col1a1-203 ， Col1a1-2http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Splice?db=core;g=ENSMUSG000506;r=11:94936224-94953042）（图 1-1），只有 Col1a1-201 转录本可以翻译白质，因此以该转录本作为研究对象。I 型成骨不全小鼠 Col1a1 表达量降该想法与南京大学-南京生物医药研究院技术人员交流，经过协商，将 Co因 2~5 外显子作为 CRISPR/Cas9 作用的位点，如图 1-2 所示。小鼠模型构作由南京大学-南京生物医药研究院完成。图 1-1 小鼠 Col1a1 基因转录本分析
图 1-3 I 型成骨不全小鼠构建方案及基因型鉴定A. I 型成骨不全小鼠构建方案，蓝色十字代表 Cas9 核酸内切酶作用位点，绿框代表Col1a1 基因 2~5 外显子，绿框之间的直线表示内含子，F 和 R 表示 PCR 上下游引物位置；B. Col1a1 基因 2~5 外显子被敲除后氨基酸序列预测结果， wt 表示野生型小鼠，col1a1+/-365表示杂合小鼠；C. 琼脂糖凝胶电泳结果，M 表示 2 kb DNA marker，B 表示无 DNA 模板的空白对照，wt 表示野生型对照。1.2.2 col1a1+/-365小鼠基本特征col1a1+/-365小鼠以及同窝野生型小鼠见图 1-4A，从图中可以看出与同窝野生型小鼠相比，col1a1+/-365小鼠身形偏小。对其体重连续监测，结果如图 1-4B所示，与同窝相同周龄的野生型小鼠相比，col1a1+/-365小鼠体重更轻。将获得的col1a1+/-365小鼠互相交配，未得到 Col1a1 基因全部缺失的纯合小鼠，文献报道，Col1a1 基因编码的 I 型胶原蛋白遍布全身，Col1a1 基因全部敲除的纯合子小鼠会出现胚胎致死现象，因此本研究未得到 Col1a1 基因全部缺失的纯合小鼠可能由于胚胎致死造成[48]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Bone Remodeling and Energy Metabolism:New Perspectives[J]. Francisco J.A.de Paula,Clifford J.Rosen. Bone Research. 2013(01)
本文编号：3228921
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