利用同源重组构建大鼠甘油二酯激酶γ（DGKγ）慢病毒过表达载体
发布时间：2021-06-14 11:46
背景:慢病毒载体作为外源性转基因载体已被广泛应用,但是大鼠甘油二酯激酶γ（diacylglycerol kinase γ,DGKγ）基因慢病毒载体未见报道。目的:用同源重组的方法构建大鼠DGKγ慢病毒过表达载体。方法:提取成年SD大鼠脑组织总RNA,以反转录得到的c DNA作为模板,通过PCR反应分段扩增大鼠DGKγ基因CDS区5’端1 029 bp和3’端1 362 bp,用同源重组技术将这2个片段与线性化载体进行定向连接,构建CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒载体并进行PCR扩增及测序鉴定。经293T细胞包装后产生慢病毒,收集慢病毒感染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达并应用实时荧光定量PCR和Western blotting法检测细胞中DGKγ mRNA和蛋白的表达。结果与结论:CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒载体经PCR扩增和测序鉴定构建成功;经CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒感染后的293T细胞,荧光显微镜下呈GFP阳性,实时荧光定量PCR显示DGKγ mRNA的表达较空载体组显著升高（P <0.01）,Western blotting显示...
【文章来源】：中国组织工程研究. 2020,24(02)北大核心
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
DGKγCDS区PCR产物测序结果Figure2SequencingresultofPCRproductofCDSofDGKγgeneISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH
HI酶切后质粒图3质粒酶切前后琼脂糖凝胶电泳Figure3Agarosegelelectrophoresisbeforeandaftervectordigested图注：图中A-C为转染后0，48，72h，箭头：细胞融合；D-E为感染后24h，D为空载体慢病毒感染组，E为CMV-ratDGKγ-GFP慢病毒感染组。标尺=50μm图5质粒转染和慢病毒感染后293T细胞Figure5Photographyof293Tcellsafterplasmidtransfectionandlentiviralinfection图注：图中A为DGKγmRNA的表达；B为DGKγ蛋白的表达。与vector比，aP<0.01,bP<0.001图6慢病毒感染后293T细胞中DGKγ的表达Figure6ExpressionofDGKγin293Tcellsafterlentiviralinfection图注：M：DNAmarker，CDS：DGKγCDS区，F1：片段一，F2：片段二图4琼脂糖凝胶电泳分析阳性克隆的PCR产物Figure4PCRproductsanalysisofpositiveclonesbyagarosegelelectrophoresisM12bp20001000750500250100bp15000100007500500025001000250CDSF1F2CDSF1F2MPlasmid1Plasmid2DGKγmRAN相对表达DGKγ蛋白相对表达abAB
HI酶切后质粒图3质粒酶切前后琼脂糖凝胶电泳Figure3Agarosegelelectrophoresisbeforeandaftervectordigested图注：图中A-C为转染后0，48，72h，箭头：细胞融合；D-E为感染后24h，D为空载体慢病毒感染组，E为CMV-ratDGKγ-GFP慢病毒感染组。标尺=50μm图5质粒转染和慢病毒感染后293T细胞Figure5Photographyof293Tcellsafterplasmidtransfectionandlentiviralinfection图注：图中A为DGKγmRNA的表达；B为DGKγ蛋白的表达。与vector比，aP<0.01,bP<0.001图6慢病毒感染后293T细胞中DGKγ的表达Figure6ExpressionofDGKγin293Tcellsafterlentiviralinfection图注：M：DNAmarker，CDS：DGKγCDS区，F1：片段一，F2：片段二图4琼脂糖凝胶电泳分析阳性克隆的PCR产物Figure4PCRproductsanalysisofpositiveclonesbyagarosegelelectrophoresisM12bp20001000750500250100bp15000100007500500025001000250CDSF1F2CDSF1F2MPlasmid1Plasmid2DGKγmRAN相对表达DGKγ蛋白相对表达abAB
【参考文献】：
期刊论文
[1]GPRC6A过表达前列腺癌细胞株构建及EMT相关研究[J]. 盛彬,杨帆,孙心旖,陈瑶,李莉,杨建一,杜圣家,刘铭. 中国生物工程杂志. 2017(03)
[2]甘油二酯激酶γ参与大鼠胚胎脑神经上皮细胞的发育[J]. 牛宝贝,崔慧林,曹锡梅,师亮,马晋峰,乔从进. 解剖学报. 2016(04)
[3]DNA克隆和组装技术研究进展[J]. 史晏榕,孙宇辉. 微生物学通报. 2015(11)
[4]人iASPP全长CDS的分段扩增、克隆及鉴定[J]. 陈杰,辛海明,蔡云,侯露,王刚,刘利,卢欣,钟山,刘泽军. 第三军医大学学报. 2007(11)
本文编号：3229764
【文章来源】：中国组织工程研究. 2020,24(02)北大核心
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
DGKγCDS区PCR产物测序结果Figure2SequencingresultofPCRproductofCDSofDGKγgeneISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH
HI酶切后质粒图3质粒酶切前后琼脂糖凝胶电泳Figure3Agarosegelelectrophoresisbeforeandaftervectordigested图注：图中A-C为转染后0，48，72h，箭头：细胞融合；D-E为感染后24h，D为空载体慢病毒感染组，E为CMV-ratDGKγ-GFP慢病毒感染组。标尺=50μm图5质粒转染和慢病毒感染后293T细胞Figure5Photographyof293Tcellsafterplasmidtransfectionandlentiviralinfection图注：图中A为DGKγmRNA的表达；B为DGKγ蛋白的表达。与vector比，aP<0.01,bP<0.001图6慢病毒感染后293T细胞中DGKγ的表达Figure6ExpressionofDGKγin293Tcellsafterlentiviralinfection图注：M：DNAmarker，CDS：DGKγCDS区，F1：片段一，F2：片段二图4琼脂糖凝胶电泳分析阳性克隆的PCR产物Figure4PCRproductsanalysisofpositiveclonesbyagarosegelelectrophoresisM12bp20001000750500250100bp15000100007500500025001000250CDSF1F2CDSF1F2MPlasmid1Plasmid2DGKγmRAN相对表达DGKγ蛋白相对表达abAB
HI酶切后质粒图3质粒酶切前后琼脂糖凝胶电泳Figure3Agarosegelelectrophoresisbeforeandaftervectordigested图注：图中A-C为转染后0，48，72h，箭头：细胞融合；D-E为感染后24h，D为空载体慢病毒感染组，E为CMV-ratDGKγ-GFP慢病毒感染组。标尺=50μm图5质粒转染和慢病毒感染后293T细胞Figure5Photographyof293Tcellsafterplasmidtransfectionandlentiviralinfection图注：图中A为DGKγmRNA的表达；B为DGKγ蛋白的表达。与vector比，aP<0.01,bP<0.001图6慢病毒感染后293T细胞中DGKγ的表达Figure6ExpressionofDGKγin293Tcellsafterlentiviralinfection图注：M：DNAmarker，CDS：DGKγCDS区，F1：片段一，F2：片段二图4琼脂糖凝胶电泳分析阳性克隆的PCR产物Figure4PCRproductsanalysisofpositiveclonesbyagarosegelelectrophoresisM12bp20001000750500250100bp15000100007500500025001000250CDSF1F2CDSF1F2MPlasmid1Plasmid2DGKγmRAN相对表达DGKγ蛋白相对表达abAB
【参考文献】：
期刊论文
[1]GPRC6A过表达前列腺癌细胞株构建及EMT相关研究[J]. 盛彬,杨帆,孙心旖,陈瑶,李莉,杨建一,杜圣家,刘铭. 中国生物工程杂志. 2017(03)
[2]甘油二酯激酶γ参与大鼠胚胎脑神经上皮细胞的发育[J]. 牛宝贝,崔慧林,曹锡梅,师亮,马晋峰,乔从进. 解剖学报. 2016(04)
[3]DNA克隆和组装技术研究进展[J]. 史晏榕,孙宇辉. 微生物学通报. 2015(11)
[4]人iASPP全长CDS的分段扩增、克隆及鉴定[J]. 陈杰,辛海明,蔡云,侯露,王刚,刘利,卢欣,钟山,刘泽军. 第三军医大学学报. 2007(11)
本文编号：3229764
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