GRSF1相互作用蛋白参与miR-346上调hTERT表达的机制研究
发布时间：2021-07-03 00:36
【目的】MicroRNA（miRNA）是真核细胞中广泛存在的长约22nt的高度保守的单链非编码RNA分子,一般在转录后水平下调基因的表达。越来越多的证据表明,miRNA可以激活转录或翻译。RNA结合蛋白（RBPs）作为基因表达的通用调节子,影响pre-mRNA的剪切,成熟mRNA的转运,定位,代谢和翻译。RBPs可以通过直接或间接与miRNA相互作用,协同或竞争性地调控特定mRNA的表达。我们前期发现GRSF1结合miR-346的特定模序“CCGCAU”,而其侧翼序列与hTERT 3′UTR结合形成GRSF1-miR-346/hTERT mRNA复合物并促进其募集到核糖体上,从而增加hTERT的表达。本文旨在探讨GRSF1介导miR-346结合靶基因3′UTR上调其表达的详细调控分子机制。【方法】首先,我们通过Flag亲和纯化技术结合质谱分析筛选GRSF1的相互作用蛋白,查阅大量文献后初步确定可能与GRSF1功能相关的候选蛋白;通过免疫共沉淀实验和免疫荧光实验结合激光共聚焦显微镜分析候选蛋白与GRSF1是否存在相互作用和共定位。接着,我们构建了一系列KIF11,RPS2,Ago2,TR...
【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校
【文章页数】：129 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
miR-346与hTERT3′UTR配对结合模式图
天津医科大学博士学位论文子，我们在 HeLa 细胞中分别转染空载体对照质粒及 Flag-GRSF1 质粒，采用 Flag亲和纯化结合银染、质谱分析筛选可能与 GRSF1 存在相互作用的蛋白。结果表明，GRSF1 与 225 个蛋白共纯化，包括 ACOT9，TFAM，HSD17B10，RPL14，已经有文献报道这些蛋白与 GRSF1 存在相互作用。有趣的是，在 GRSF1 蛋白复合物中还发现了丰度较高的运动蛋白 KIF11、23 个翻译相关蛋白和 E3 泛素连接酶 TRIM21（图 1.1A，B）。通过查阅大量文献分析蛋白功能，我们推测 KIF11，RPS2，RPL29，TRIM21 可能参与 GRSF1 介导的 miR-346 对 hTERT 表达的上调，并对这四个蛋白进行深入研究。
外源性 GRSF1 与 KIF11，RPS2，TRIM21 相Flag-GRSF1 质粒，转染 48h 后用 Flag-tag 抗 Flag-GRSF1 及内源性 KIF11，RPS2，RPL内源性 GRSF1 与候选蛋白的相互作用IF11，RPS2，TRIM21 与 GRSF1 在体和 HEK-293T 细胞中，用 GRSF1 的抗11，RPS2，RPL29，TRIM21 的表达情RPL29，TRIM21 的抗体进行免疫共 1.3 B），结果表明内源性 GRSF1 与内，但与内源性 RPL29 不存在相互作用
本文编号：3261498
【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校
【文章页数】：129 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
miR-346与hTERT3′UTR配对结合模式图
天津医科大学博士学位论文子，我们在 HeLa 细胞中分别转染空载体对照质粒及 Flag-GRSF1 质粒，采用 Flag亲和纯化结合银染、质谱分析筛选可能与 GRSF1 存在相互作用的蛋白。结果表明，GRSF1 与 225 个蛋白共纯化，包括 ACOT9，TFAM，HSD17B10，RPL14，已经有文献报道这些蛋白与 GRSF1 存在相互作用。有趣的是，在 GRSF1 蛋白复合物中还发现了丰度较高的运动蛋白 KIF11、23 个翻译相关蛋白和 E3 泛素连接酶 TRIM21（图 1.1A，B）。通过查阅大量文献分析蛋白功能，我们推测 KIF11，RPS2，RPL29，TRIM21 可能参与 GRSF1 介导的 miR-346 对 hTERT 表达的上调，并对这四个蛋白进行深入研究。
外源性 GRSF1 与 KIF11，RPS2，TRIM21 相Flag-GRSF1 质粒，转染 48h 后用 Flag-tag 抗 Flag-GRSF1 及内源性 KIF11，RPS2，RPL内源性 GRSF1 与候选蛋白的相互作用IF11，RPS2，TRIM21 与 GRSF1 在体和 HEK-293T 细胞中，用 GRSF1 的抗11，RPS2，RPL29，TRIM21 的表达情RPL29，TRIM21 的抗体进行免疫共 1.3 B），结果表明内源性 GRSF1 与内，但与内源性 RPL29 不存在相互作用
本文编号：3261498
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