副溶血弧菌拟核相关蛋白H-NS间接抑制VP1687-1686的启动子区转录

发布时间：2021-07-09 08:15

　　为了探讨副溶血弧菌拟核相关蛋白H-NS对Ⅲ型分泌系统（T3SS） VP1687-1686基因位点的转录调控,本研究提取副溶血弧菌hns突变株（Δhns）和野生株（WT）的总RNA,采用引物延伸实验研究靶基因的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对靶基因的调控关系;采用实时定量RT-PCR研究靶基因mRNA在WT和Δhns中转录丰度,以判定H-NS对靶基因的转录调控关系;将靶基因启动子区域DNA序列克隆至lacZ基因上游,将重组质粒转入WT和Δhns中,得到相应的LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合实验研究H-NS对靶基因的调控关系;用PCR扩增靶基因的启动子区DNA序列,并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验（EMSA）研究His-H-NS是否对靶基因启动子区具有直接的结合作用。研究结果显示,T3SS的VP1687-1686只含有一个转录起始位点,位于翻译起始位点上游82 bp处,且H-NS能够抑制其转录活性,但不能直接结合到VP1687-1686区的启动子区。另外,H-NS对calR的转录无调控作用,His-H-NS也不能结合到其启动子区。本研究的结果初步说明,H-NS... 

【文章来源】：基因组学与应用生物学. 2020,39(05)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

FGF/FGFR信号通路

H-NS抑制VP1687的转录

首先采用引物延伸实验研究H-NS对calR基因的调控关系，结果显示calR的转录起始位点为T，位于起始密码子ATG上游156 bp，且WT和Δhns中calR基因的mRNA表达量没有差异(图3A)。然后利用qRT-PCR研究calR基因的m RNA在WT和Δhns中转录丰度，qRT-PCR鉴定结果显示(图3B):WT和Δhns中VP1687 m RNA丰度没有明显差异，表明H-NS不调控calR基因的转录，此结果与引物延伸结果一致。进一步在体外进行的Lac Z报告基因融合实验结果显示：Δhns中测得的β-半乳糖苷酶活性与WT基本相同，无显著性差异(图3C)，这同样说明H-NS不调控calR基因的转录。最后利用EMSA实验验证H-NS是否对calR的启动子区DNA具有直接的结合作用，结果显示H-NS不与calR基因的启动子区结合(图3D)。综合上述结果：H-NS不调控calR的转录，也不能结合到calR的启动区，表明H-NS不能通过调控calR的转录来调控T3SS1的表达。


本文编号：3273380