假结核耶尔森氏菌三型分泌系统相互作用蛋白筛选及其功能研究

发布时间：2017-04-27 16:18

  本文关键词：假结核耶尔森氏菌三型分泌系统相互作用蛋白筛选及其功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：三型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)是革兰氏阴性致病菌重要的毒力分泌系统。耶尔森氏菌T3SS由pYV或者pCD毒力质粒编码,通过针状注射体结构将毒力效应因子(Yops蛋白)分泌至宿主细胞内,达到致病目的。耶尔森氏菌Ysc-Yop T3SS装置的组装和Yops蛋白的分泌过程非常复杂,研究蛋白之间的相互作用,对深入了解装置组装过程,完善Yops分泌机制具有重要意义。本研究以假结核耶尔森氏菌为研究对象,采用细菌双杂交对pYV毒力质粒编码的T3SS相关蛋白进行全面筛选,并对筛选得到的相互作用蛋白进行系统分析。通过文献调研,选择本研究中新发现的可能对T3SS分泌过程有重要意义的相互作用蛋白进行深入研究,进一步完善对T3SS装置组装与Yops蛋白分泌过程的了解。论文主要包括以下三方面的内容:1.pYV毒力质粒上T3SS相互作用蛋白的筛选:通过细菌双杂交蓝白斑法初筛及β半乳糖苷酶活性测定复筛,共筛选到43对相互作用蛋白,其中22对已经有文献报道。21对尚未有文献报道的相互作用蛋白有12对为自身相互作用蛋白,说明这些蛋白可能以多聚体的形式发挥作用。结合文献报道,发现YscQ和YscO是T3SS正常发挥生理功能不可或缺的,但具体作用机制并不清楚,YopH与YopM的分泌过程也并不清楚,最终选择YopH-YscQ和YopM-YscO作为研究对象,探讨YscQ,YscO分别在YopH,YopM分泌过程是否发挥作用。2.YopH-YscQ和YopM-YscO相互作用验证:通过体外Pull-down确定YopH-YscQ、YopM-YscO存在相互作用;通过对YopH、YscQ、YopM、YscO蛋白结构进行分析,构建不同的截短克隆,利用细菌双杂交寻找作用区域。最终确定YopH N端对分泌转运起关键作用的1-140aa与YscQ 218aa-C具有相互作用,而yscQ编码全长YscQ及YscQc,YscQc与YscQ218aa-C序列一致,推测全长YscQ的218aa-C区域与YscQc在YopH的分泌转运过程可能发挥作用;而YopM N端与分泌转运相关的1-100aa与YscO具有相互作用,但YscO上的作用区域未能确定,YopM与YscO的相互作用可能依赖于YscO结构的完整性。3.YscQ和YscQc功能分析:体外Pull-down验证YscQc与YopH存在相互作用,YscQ、YscQc是T3SS发挥功能必需。通过寻找YscQc与YopH相互作用位点及对YopH分泌的影响,本研究首次发现YscQ和YscQc过表达对Yops分泌具有反馈抑制作用,并且这种反馈抑制可通过lcrQ的缺失得以解除,这为进一步研究YscQ/YscQc对T3SS的调控机制及LcrQ的分泌机制奠定了基础。
【关键词】：耶尔森氏菌 三型分泌系统 蛋白-蛋白相互作用 YscQ YopH YopM
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(武汉病毒研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 致谢4-6
• 摘要6-7
• SUMMARY7-12
• 第一章 引言12-30
• 1.1 耶尔森氏菌简介12
• 1.2 耶尔森氏菌三型分泌系统简介12-18
• 1.2.1 细菌分泌系统简介12-14
• 1.2.2 耶尔森氏菌T3SS14-15
• 1.2.3 耶尔森氏菌T3SS结构15-16
• 1.2.4 耶尔森氏菌T3SS功能16-18
• 1.3 耶尔森氏菌T3SS调控18-22
• 1.3.1 pYV毒力质粒编码的蛋白对T3SS的调控18-21
• 1.3.2 染色体上编码的蛋白对T3SS的调控21-22
• 1.3.3 环境因素对T3SS的调控22
• 1.4 耶尔森氏菌T3SS蛋白分泌机制研究进展22-26
• 1.5 耶尔森氏菌T3SS相互作用蛋白研究进展26-29
• 1.6 本研究的目的和意义29
• 1.7 本研究的主要内容29-30
• 第二章 pYV毒力质粒上相互作用蛋白的筛选30-40
• 2.1 引言30
• 2.2 材料与方法30-33
• 2.2.1 菌株与质粒30-31
• 2.2.2 引物信息31
• 2.2.3 pYV毒力质粒上基因细菌双杂交克隆库的构建31
• 2.2.4 细菌双杂交筛选相互作用蛋白31-32
• 2.2.5 β半乳糖苷酶活性测定对相互作用蛋白的复筛32
• 2.2.6 数据统计学分析32-33
• 2.3 实验结果33-39
• 2.3.1 pYV毒力质粒相互作用蛋白初筛33-35
• 2.3.2 pYV毒力质粒相互作用蛋白复筛35-39
• 2.4 讨论39-40
• 第三章 Ysc Q/YopH，Ysc O/YopM相互作用机制初步研究40-53
• 3.1 引言40
• 3.2 材料与方法40-46
• 3.2.1 菌株和质粒40-43
• 3.2.2 引物信息43
• 3.2.3 YscQ和YopH相互作用体外验证43-45
• 3.2.4 YscO和YopM相互作用体外验证45
• 3.2.5 yscO、yopM、yscQ、yopH细菌双杂交截短克隆的构建45-46
• 3.2.6 细菌双杂交寻找YscO/YopM、YscQ/YopH相互作用区域46
• 3.3 实验结果46-51
• 3.3.1 相互作用体外验证46-48
• 3.3.2 相互作用区域寻找48-51
• 3.4 讨论51-53
• 第四章 Ysc Q、YscQc功能分析53-65
• 4.1 引言53
• 4.2 材料与方法53-58
• 4.2.1 菌株和质粒53-54
• 4.2.2 引物信息54
• 4.2.3 YscQc与YopH相互作用验证54-55
• 4.2.4 yscQ缺失突变体的构建55-57
• 4.2.5 ΔyscQ回复菌株的构建57
• 4.2.6 Yops蛋白提取57-58
• 4.2.7 Western-Blotting58
• 4.3 实验结果58-63
• 4.3.1 YscQc和YopH相互作用的体外验证58-59
• 4.3.2 ΔyscQ突变体的构建59-60
• 4.3.3 ΔyscQ突变体回复表型分析60-61
• 4.3.4 LcrQ参与YscQ，，YscQc对T3SS的调控作用61-63
• 4.4 讨论63-65
• 第五章 总结和展望65-68
• 参考文献68-75
• 附录 引物信息75-77
• 作者简历77

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