多不饱和脂肪酸在家蝇幼虫体内的富集及Fat1转基因家蝇的制备
发布时间：2021-08-03 13:36
目的:阐明家蝇（Musca domestica）幼虫对食物中各种多不饱和脂肪酸的富集能力以及代谢转化情况,并探究各种多不饱和脂肪酸对家蝇幼虫生长的影响。在此基础上,建立适宜家蝇的转基因方法和技术体系,为实现在家蝇体内进行多不饱和脂肪酸的内源性合成奠定基础。方法:在基础饲料中添加不同浓度（3%,6%和12%）的多不饱和脂肪酸（亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸）饲养经过脱脂传代培养的家蝇幼虫,提取家蝇幼虫的总脂肪酸,利用气相色谱仪进行检测和分析,测定幼虫体重进行统计以分析多不饱和脂肪酸对家蝇幼虫生长的影响。利用piggyBac转座子载体系统,构建Fat1基因的表达载体,然后通过显微注射法以及电穿孔法将目的基因导入家蝇卵,待发育为成蝇之后通过检测绿色荧光蛋白的表达,初步筛选出阳性个体,再提取组织DNA,通过PCR法在分子水平鉴定Fat1基因是否转入家蝇体内,从而建立转基因家蝇的技术体系。结果:亚油酸、α-亚麻酸和花生四烯酸在家蝇幼虫体内均能富集,且它们的富集程度随着食物中多不饱和脂肪酸的添加浓度的升高而增加,其中亚油酸、α-亚麻酸和花生四烯酸在幼虫体内富集的最高占比（指占体内总...
【文章来源】：贵州医科大学贵州省
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组质粒pUC57-SV40PolyA的PCR鉴定（A）和酶切鉴定(B)
20余为空载体），连同后续质粒电泳鉴定（图中未显示）可能为阳性质粒用于酶切验证，证明图3A中泳道4为阳性克隆，确实插入了PromA4片段。中间质粒载体pUC57-PromA4-SV40polyA用来克隆目的基因Fat1，将目的基因Fat1插入该质粒后，即可得到载体pUC57-PromA4-Fat1-SV40polyA。将PromA4-Fat1-SV40polyA 整 个 片 段 用 PCR 方 法 扩 增 出 来 ， 随 后 插 入 质 粒pBac[3×P3]-EGFPafm，即获得了最终转基因实验所需要的转基因家蝇表达载体pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA（图4）。在这个载体中，报告基因EGFP被在昆虫眼部特异性表达的启动子3×P3所驱动表达，有利于转基因个体的筛选；而外源目的基因Fat1将被来源于家蚕的肌动蛋白启动子PromA4所驱动表达。图4A为重组质粒pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA的PCR鉴定
PromA4-Fat1-SV40polyA 整 个 片 段 用 PCR 方 法 扩 增 出 来 ， 随 后 插 入 质 粒pBac[3×P3]-EGFPafm，即获得了最终转基因实验所需要的转基因家蝇表达载体pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA（图4）。在这个载体中，报告基因EGFP被在昆虫眼部特异性表达的启动子3×P3所驱动表达，有利于转基因个体的筛选；而外源目的基因Fat1将被来源于家蚕的肌动蛋白启动子PromA4所驱动表达。图4A为重组质粒pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA的PCR鉴定，其中3号和4号为阳性克隆，经酶切验证确实插入了目的DNA片段。最后，将阳性克隆测序鉴定，证明目的基因Fat1序列没有发生变化，可用于后续实验。图 2 重组质粒 pUC57-SV40PolyA 的 PCR 鉴定（A）和酶切鉴定(B)Fig. 2 Identification
【参考文献】：
期刊论文
[1]家蚕表皮和体内的游离脂肪酸组成以及对白僵菌的抑制作用[J]. 邢东旭,李庆荣,肖阳,叶明强,刘新涛,杨琼. 蚕业科学. 2017(01)
[2]果蝇组织中多不饱和脂肪酸代谢产物——类二十烷酸的高效液相色谱-串联质谱法测定[J]. 谭量量,沈立荣. 浙江大学学报(农业与生命科学版). 2016(01)
[3]哺乳动物细胞多不饱和脂肪酸合成酶系的重建将亚油酸代谢转变为二十二碳六烯酸[J]. 朱贵明,Abdulmomen Ali Mohammed Saleh,Said Ahmed Bahwal,邱立红,孙洁,商宇,江旭东,葛堂栋,张涛. 生物工程学报. 2015(02)
[4]家蝇蛆油脂的GC-MS分析及合成生物柴油的研究[J]. 陈倩文,蔡子哲,汪勇,黄妙玲,朱龙平,何国瑞,杨得坡. 可再生能源. 2014(05)
[5]豆天蛾氨基酸及脂肪酸分析与评价[J]. 田华,张义明. 食品科技. 2012(05)
[6]Shiva-1a基因在杆状病毒中的表达及其表达产物抑菌活性的检测[J]. 许丹,许信刚,王志昇,闫东东,童德文. 西北农业学报. 2011(06)
[7]piggyBac转座子及其转基因昆虫的应用[J]. 唐丽莉,陈斌,何正波,李廷景. 安徽农业科学. 2010(06)
[8]蝇蛆营养成分的测定与评价[J]. 白钢,张翼翔. 包头医学院学报. 2010(01)
[9]人脑源性神经营养因子基因（hBDNF）在转基因家蚕丝腺中的特异表达[J]. 段建平,徐汉福,马三垣,邓党军,王峰,夏庆友. 蚕业科学. 2009(02)
[10]piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探[J]. 周文林,王崇龙,刘波,曹广力,薛仁宇,沈卫德,贡成良. 蚕业科学. 2007(01)
本文编号：3319714
【文章来源】：贵州医科大学贵州省
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组质粒pUC57-SV40PolyA的PCR鉴定（A）和酶切鉴定(B)
20余为空载体），连同后续质粒电泳鉴定（图中未显示）可能为阳性质粒用于酶切验证，证明图3A中泳道4为阳性克隆，确实插入了PromA4片段。中间质粒载体pUC57-PromA4-SV40polyA用来克隆目的基因Fat1，将目的基因Fat1插入该质粒后，即可得到载体pUC57-PromA4-Fat1-SV40polyA。将PromA4-Fat1-SV40polyA 整 个 片 段 用 PCR 方 法 扩 增 出 来 ， 随 后 插 入 质 粒pBac[3×P3]-EGFPafm，即获得了最终转基因实验所需要的转基因家蝇表达载体pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA（图4）。在这个载体中，报告基因EGFP被在昆虫眼部特异性表达的启动子3×P3所驱动表达，有利于转基因个体的筛选；而外源目的基因Fat1将被来源于家蚕的肌动蛋白启动子PromA4所驱动表达。图4A为重组质粒pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA的PCR鉴定
PromA4-Fat1-SV40polyA 整 个 片 段 用 PCR 方 法 扩 增 出 来 ， 随 后 插 入 质 粒pBac[3×P3]-EGFPafm，即获得了最终转基因实验所需要的转基因家蝇表达载体pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA（图4）。在这个载体中，报告基因EGFP被在昆虫眼部特异性表达的启动子3×P3所驱动表达，有利于转基因个体的筛选；而外源目的基因Fat1将被来源于家蚕的肌动蛋白启动子PromA4所驱动表达。图4A为重组质粒pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA的PCR鉴定，其中3号和4号为阳性克隆，经酶切验证确实插入了目的DNA片段。最后，将阳性克隆测序鉴定，证明目的基因Fat1序列没有发生变化，可用于后续实验。图 2 重组质粒 pUC57-SV40PolyA 的 PCR 鉴定（A）和酶切鉴定(B)Fig. 2 Identification
【参考文献】：
期刊论文
[1]家蚕表皮和体内的游离脂肪酸组成以及对白僵菌的抑制作用[J]. 邢东旭,李庆荣,肖阳,叶明强,刘新涛,杨琼. 蚕业科学. 2017(01)
[2]果蝇组织中多不饱和脂肪酸代谢产物——类二十烷酸的高效液相色谱-串联质谱法测定[J]. 谭量量,沈立荣. 浙江大学学报(农业与生命科学版). 2016(01)
[3]哺乳动物细胞多不饱和脂肪酸合成酶系的重建将亚油酸代谢转变为二十二碳六烯酸[J]. 朱贵明,Abdulmomen Ali Mohammed Saleh,Said Ahmed Bahwal,邱立红,孙洁,商宇,江旭东,葛堂栋,张涛. 生物工程学报. 2015(02)
[4]家蝇蛆油脂的GC-MS分析及合成生物柴油的研究[J]. 陈倩文,蔡子哲,汪勇,黄妙玲,朱龙平,何国瑞,杨得坡. 可再生能源. 2014(05)
[5]豆天蛾氨基酸及脂肪酸分析与评价[J]. 田华,张义明. 食品科技. 2012(05)
[6]Shiva-1a基因在杆状病毒中的表达及其表达产物抑菌活性的检测[J]. 许丹,许信刚,王志昇,闫东东,童德文. 西北农业学报. 2011(06)
[7]piggyBac转座子及其转基因昆虫的应用[J]. 唐丽莉,陈斌,何正波,李廷景. 安徽农业科学. 2010(06)
[8]蝇蛆营养成分的测定与评价[J]. 白钢,张翼翔. 包头医学院学报. 2010(01)
[9]人脑源性神经营养因子基因（hBDNF）在转基因家蚕丝腺中的特异表达[J]. 段建平,徐汉福,马三垣,邓党军,王峰,夏庆友. 蚕业科学. 2009(02)
[10]piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探[J]. 周文林,王崇龙,刘波,曹广力,薛仁宇,沈卫德,贡成良. 蚕业科学. 2007(01)
本文编号：3319714
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