基于CRISPR/Cas9技术构建自闭症风险基因katnal2斑马鱼突变模型

发布时间：2021-08-12 11:03

　　目的:通过CRISPR/Cas9技术敲除自闭症风险基因katnal2,建立稳定的katnal2基因突变的斑马鱼模型,通过斑马鱼突变模型研究katnal2基因对发育的影响。方法:通过整胚原位杂交实验及qPCR实验观察斑马鱼katnal2基因在早期发育阶段的时空表达谱。通过斑马鱼的katnal2基因信息,设计合适的靶位点,制备相应的gRNA和有效的Cas9 m RNA。采用斑马鱼胚胎显微注射技术将gRNA和Cas9 m RNA的混合体系注射入单细胞胚胎卵黄中,48hpf后通过T7E1酶切及Sanger测序检测gRNA的打靶有效性。使用Sanger测序筛选出F1代斑马鱼突变体,采用genotyping-PCR反应筛选F2代纯合突变体,并通过qPCR实验检测katnal2基因敲除后的表达情况。在显微镜下观察野生型及F3代斑马鱼纯合突变体胚胎的早期发育状态并在5dpf时测量其幼鱼的体长进行比较分析,再对6dpf的幼鱼进行明暗刺激实验。结果:qPCR和原位杂交结果显示katnal2在早期发育阶段表达量低,24 hpf之前全身表达,24 hpf之后主要在脑部表达。T7E1酶切和Sanger测序的结果... 

【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

katnal2突变自闭症患者突变信息

图 2：斑马鱼 katnal2 基因的结构信息。斑马鱼 katnal2 基因有 14 个外显子，只有一种转录本，蛋白上的主要结构域是 LisH 和 AAA 结构域。1.3 斑马鱼作为模式生物在社会神经生物学研究中，斑马鱼正在迅速成为介于体外研究和哺乳动物体内研究的新型有效模型。经过多年的研究应用及发展，约有 20 个斑马鱼品系，目前最常见的为 AB 品系和 Tubingen 品系，且在专门的斑马鱼信息数据库 ZFIN

图 3 CRISPR/Cas9 体系电泳图。 A: gRNA1 和 gRNA2 体外转录模板；B: Cas9 mRNA 及gRNA1 和 gRNA2 体外转录后获得的 RNA。3.1.3 获得 CRISPR/Cas9 混合体系分别将获得的 katnal2 特异性 gRNA1 和 gRNA2 与 Cas9 mRNA 以一定比例混合，使得 gRNA 和 Cas9 mRNA 的终浓度分别为 40 ng/ L 和 300 ng/ L,以便用于单细胞期胚胎显微注射。3.2 F0 代斑马鱼胚胎突变有效性鉴定分别随机挑取注射组及对照组的胚胎提取基因组 DNA 进行突变验证，验证的方法主要有对 PCR 产物进行 T7E1 酶切和将 PCR 产物进行 Sanger 测序。用于扩增靶序列靶向位置所在区域 DNA 片段的引物序列如下所示：Katnal2_cp1_check_F 5'-GCGTATTTCTTCCCGTTTGC-3'


本文编号：3338203