口服轮状病毒铁蛋白纳米疫苗生物反应器的制备及免疫学功能的初步研究
发布时间：2021-09-22 12:17
生物反应器搭建了现代动物生物技术与药用蛋白表达制药技术的桥梁,是现代生物技术领域的研究热点,应用生物反应器来制备口服疫苗的研究,国内外鲜有报道。本研究针对人畜共患轮状病毒病,设计了口服铁蛋白纳米疫苗生物反应器,并通过小鼠模型,对其免疫原性与保护能力进行了初步的验证。研究结果如下:1、人轮状病毒VP6蛋白及铁蛋白Ferritin的原核表达及功能研究通过NCBI数据库获取人轮状病毒VP6基因和铁蛋白（Helicobacter pylor/non-haem iron-containing ferritin）的核苷酸序列,并克隆到pET-32a载体上。之后使用大肠杆菌表达系统表达得到了 rferritin,rVP6以及rVP6-ferritin融合蛋白,并对三种蛋白的IPTG诱导浓度、诱导时间和起始诱导菌液浓度（OD600）等表达条件进行了优化探索。通过Ni2+亲和层析及分子筛等方法纯化得到了 ferritin,rVP6和rVP6-ferritin蛋白。使用透射电子显微镜观察复性后的ferritin蛋白和VP6-ferritin可见两种蛋白可以形成相似的纳米颗粒,粒径均一。使用纯化得到的重组蛋...
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：118 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１轮病毒性腹泻引起的儿童死亡率的世界分布地图
—??二??图１－１轮病毒性腹泻引起的儿童死亡率的世界分布地图。阴影代表每个孩子５岁时的死亡风险??［３］??〇??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１：?Ｍａｐ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｗｏｒｌｄ?ｗｉｔｈ?ｅｓｔｉｍａｔｅｄ?ｍｏｒｔａｌｉｔｙ?ｆｒｏｍ?ｒｏｔａｖｉｒｕｓ?ｄｉａｒｒｈｅａ?Ｓｈａｄｉｎｇ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?ｒｉｓｋ??ｏｆ?ｄｅａｔｈ?ｐｅｒ?ｃｈｉｌｄ?ｂｙ?５?ｙｅａｒｓ?ｏｆ?ａｇｅ．??１．１．１轮状病毒的结构??轮状病毒（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ，?ＲＶ）是一种双链ＲＮＡ病毒，属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属??［２６］。１９７３年，澳大利亚学者Ｂｉｓｈｏｐ首先在胃肠炎患者的十二指肠超薄切片中发现了轮状??病毒，并在随后的研究中确定了轮状病毒与人类以及动物胃肠炎的关系［２７］，由于在电??子显微镜下其形似车轮状，故命名为轮状病毒［２８］。成熟的轮状病毒颗粒是一个二十面??体结构，在电子显微镜下呈现为直径约为６５－７５ｍｎ的特异性双层衣壳结构［２９，３（）］。轮状??病毒基因组由１１个双链ＲＮＡ片段组成，包含在内层衣壳中，分别编码６个结构蛋白??（ＶＰ１－４，?ＶＰ６，?ＶＰ７）和５个非结构蛋白（ＮＳＰ１－５）。其中，基因片段１，２，３和６分别编??码核蛋白ＶＰ１
染病的传播和爆发提供了一种非常有效的机制，每年可预防数百万人的发病率和死亡率??ｆ１５＇自第一个疫苗被应用以来，疫苗的研发依次经历了异型毒株疫苗，减毒株疫苗，灭??活毒株疫苗，类毒素疫苗，病毒亚单位疫苗，重组活毒株疫苗和纳米疫苗等（图１－３）。??１８００?１９００?２０００??Ｊ?｜?｜????［＿?Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ???Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ?ｌｌｌｌ???…Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ???：＿?—??ｆＳＺ—：——?Ｔｏｘｏｉｄ??：Ｓｕｂｕｎｉｔ??Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ??图１－３不同类型疫苗的发展时间表。虚线表示这些种类在可预见的将来很可能仍然很重要［１５７］。由??冷色到暖色代表研究热度。??Ｆｉｇ．?１－３?Ａ?ｔｉｍｅｌｉｎｅ?ｓｈｏｗｉｎｇ?ｗｈｅｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｌａｓｓｅｓ?ｏｆ?ｖａｃｃｉｎｅｓ?ｂｅｃａｍｅ?ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ?ａｖａｉｌａｂｌｅ?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｏｖｅｒｌａｐ??ｏｆ?ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ．?Ｌｉｇｈｔｅｒ／ｄａｓｈｅｄ?ｃｏｌｏｒｓ?ｉｎｄｉｃａｔｅ?ｔｈａｔ?ｔｈｅｓｅ?ｃｌａｓｓｅｓ?ｗｉｌｌ?ｍｏｓｔ?ｌｉｋｅｌｙ?ｒｅｍａｉｎ?ｉｍｐｏｒｔａｎｔ?ｆｏｒ?ｔｈｅ??ｆｏｒｅｓｅｅａｂｌｅ?ｆｕｔｕｒｅ?［１５７］．??世界卫生组织认为理想疫苗应该具备适用性广泛，免疫原性高且病原性较低，通过??无针头方式接种，易于大规模生产且质控方式简便和易于储存及运输。疫苗开发最开始??关注的是利用不同来源的病原体作为疫苗，要么是减毒活疫苗，要么是灭活疫苗。虽然??在许多不同的传染性疾病中取得了成功
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组水蛭素的原核表达及分离纯化[J]. 黄孔威,李志鹏,崔奎青,石德顺,刘庆友. 中国畜牧兽医. 2018(01)
[2]铁蛋白纳米颗粒应用于生物医疗领域的研究进展[J]. 李志鹏,刘庆友,石德顺. 生物技术通报. 2015(10)
[3]重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定[J]. 范芳芳,孙慧莹,徐晖,刘佳玮,张海员,李亦兰,宁雪莲,孙悦,白静,傅松滨,周春水. 生物工程学报. 2015(12)
[4]合成生物学技术研究进展[J]. 吕永坤,堵国成,陈坚,周景文. 生物技术通报. 2015(04)
[5]确认我国轮状病毒疫苗株LLR基因型为G10P[15][J]. 李丹地,徐子乾,谢广成,刘娜,王宏,章青,孙晓曼,郭妮君,庞立丽,段招军. 病毒学报. 2015(02)
[6]家蝇抗真菌肽MAF-1原核表达条件优化及活性验证[J]. 彭传林,魏川川,吴建伟,王宇,修江帆,罗振华. 中国公共卫生. 2015(11)
[7]铁蛋白纳米粒子的修饰及细胞内化特性的研究[J]. 黄培森,沈阳,王焦清,黄雅佩,李旭,周艳,詹家荣,曹旭妮. 化学试剂. 2015(01)
[8]一种高效、稳定的可溶性原核表达载体的构建及应用[J]. 高闪电,常惠芸,独军政,丛国正,邵军军,林彤. 华北农学报. 2009(06)
[9]转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株的筛选[J]. 王春生,刘欣,原璐,安铁洙. 畜牧兽医学报. 2009(08)
[10]鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达（ 英文）[J]. 聂新民,张必成,向娟娟,朱诗国,周鸣,董利,余鹰,李小玲,李桂源. 生物化学与生物物理进展. 2002(04)
博士论文
[1]抗纹枯病转基因水稻的培育[D]. 卢燎勋.华中农业大学 2013
[2]轮状病毒疫苗在我国应用的评价研究[D]. 刘娜.中国疾病预防控制中心 2012
[3]基因优化的表达人轮状病毒重组腺病毒免疫效果研究[D]. 王敏.中国疾病预防控制中心 2008
硕士论文
[1]以Ad41为载体的轮状病毒疫苗免疫效果初探[D]. 陈多灵.山东大学 2012
本文编号：3403747
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：118 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１轮病毒性腹泻引起的儿童死亡率的世界分布地图
—??二??图１－１轮病毒性腹泻引起的儿童死亡率的世界分布地图。阴影代表每个孩子５岁时的死亡风险??［３］??〇??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１：?Ｍａｐ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｗｏｒｌｄ?ｗｉｔｈ?ｅｓｔｉｍａｔｅｄ?ｍｏｒｔａｌｉｔｙ?ｆｒｏｍ?ｒｏｔａｖｉｒｕｓ?ｄｉａｒｒｈｅａ?Ｓｈａｄｉｎｇ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?ｒｉｓｋ??ｏｆ?ｄｅａｔｈ?ｐｅｒ?ｃｈｉｌｄ?ｂｙ?５?ｙｅａｒｓ?ｏｆ?ａｇｅ．??１．１．１轮状病毒的结构??轮状病毒（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ，?ＲＶ）是一种双链ＲＮＡ病毒，属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属??［２６］。１９７３年，澳大利亚学者Ｂｉｓｈｏｐ首先在胃肠炎患者的十二指肠超薄切片中发现了轮状??病毒，并在随后的研究中确定了轮状病毒与人类以及动物胃肠炎的关系［２７］，由于在电??子显微镜下其形似车轮状，故命名为轮状病毒［２８］。成熟的轮状病毒颗粒是一个二十面??体结构，在电子显微镜下呈现为直径约为６５－７５ｍｎ的特异性双层衣壳结构［２９，３（）］。轮状??病毒基因组由１１个双链ＲＮＡ片段组成，包含在内层衣壳中，分别编码６个结构蛋白??（ＶＰ１－４，?ＶＰ６，?ＶＰ７）和５个非结构蛋白（ＮＳＰ１－５）。其中，基因片段１，２，３和６分别编??码核蛋白ＶＰ１
染病的传播和爆发提供了一种非常有效的机制，每年可预防数百万人的发病率和死亡率??ｆ１５＇自第一个疫苗被应用以来，疫苗的研发依次经历了异型毒株疫苗，减毒株疫苗，灭??活毒株疫苗，类毒素疫苗，病毒亚单位疫苗，重组活毒株疫苗和纳米疫苗等（图１－３）。??１８００?１９００?２０００??Ｊ?｜?｜????［＿?Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ???Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ?ｌｌｌｌ???…Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ???：＿?—??ｆＳＺ—：——?Ｔｏｘｏｉｄ??：Ｓｕｂｕｎｉｔ??Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ??图１－３不同类型疫苗的发展时间表。虚线表示这些种类在可预见的将来很可能仍然很重要［１５７］。由??冷色到暖色代表研究热度。??Ｆｉｇ．?１－３?Ａ?ｔｉｍｅｌｉｎｅ?ｓｈｏｗｉｎｇ?ｗｈｅｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｌａｓｓｅｓ?ｏｆ?ｖａｃｃｉｎｅｓ?ｂｅｃａｍｅ?ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ?ａｖａｉｌａｂｌｅ?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｏｖｅｒｌａｐ??ｏｆ?ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ．?Ｌｉｇｈｔｅｒ／ｄａｓｈｅｄ?ｃｏｌｏｒｓ?ｉｎｄｉｃａｔｅ?ｔｈａｔ?ｔｈｅｓｅ?ｃｌａｓｓｅｓ?ｗｉｌｌ?ｍｏｓｔ?ｌｉｋｅｌｙ?ｒｅｍａｉｎ?ｉｍｐｏｒｔａｎｔ?ｆｏｒ?ｔｈｅ??ｆｏｒｅｓｅｅａｂｌｅ?ｆｕｔｕｒｅ?［１５７］．??世界卫生组织认为理想疫苗应该具备适用性广泛，免疫原性高且病原性较低，通过??无针头方式接种，易于大规模生产且质控方式简便和易于储存及运输。疫苗开发最开始??关注的是利用不同来源的病原体作为疫苗，要么是减毒活疫苗，要么是灭活疫苗。虽然??在许多不同的传染性疾病中取得了成功
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组水蛭素的原核表达及分离纯化[J]. 黄孔威,李志鹏,崔奎青,石德顺,刘庆友. 中国畜牧兽医. 2018(01)
[2]铁蛋白纳米颗粒应用于生物医疗领域的研究进展[J]. 李志鹏,刘庆友,石德顺. 生物技术通报. 2015(10)
[3]重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定[J]. 范芳芳,孙慧莹,徐晖,刘佳玮,张海员,李亦兰,宁雪莲,孙悦,白静,傅松滨,周春水. 生物工程学报. 2015(12)
[4]合成生物学技术研究进展[J]. 吕永坤,堵国成,陈坚,周景文. 生物技术通报. 2015(04)
[5]确认我国轮状病毒疫苗株LLR基因型为G10P[15][J]. 李丹地,徐子乾,谢广成,刘娜,王宏,章青,孙晓曼,郭妮君,庞立丽,段招军. 病毒学报. 2015(02)
[6]家蝇抗真菌肽MAF-1原核表达条件优化及活性验证[J]. 彭传林,魏川川,吴建伟,王宇,修江帆,罗振华. 中国公共卫生. 2015(11)
[7]铁蛋白纳米粒子的修饰及细胞内化特性的研究[J]. 黄培森,沈阳,王焦清,黄雅佩,李旭,周艳,詹家荣,曹旭妮. 化学试剂. 2015(01)
[8]一种高效、稳定的可溶性原核表达载体的构建及应用[J]. 高闪电,常惠芸,独军政,丛国正,邵军军,林彤. 华北农学报. 2009(06)
[9]转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株的筛选[J]. 王春生,刘欣,原璐,安铁洙. 畜牧兽医学报. 2009(08)
[10]鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达（ 英文）[J]. 聂新民,张必成,向娟娟,朱诗国,周鸣,董利,余鹰,李小玲,李桂源. 生物化学与生物物理进展. 2002(04)
博士论文
[1]抗纹枯病转基因水稻的培育[D]. 卢燎勋.华中农业大学 2013
[2]轮状病毒疫苗在我国应用的评价研究[D]. 刘娜.中国疾病预防控制中心 2012
[3]基因优化的表达人轮状病毒重组腺病毒免疫效果研究[D]. 王敏.中国疾病预防控制中心 2008
硕士论文
[1]以Ad41为载体的轮状病毒疫苗免疫效果初探[D]. 陈多灵.山东大学 2012
本文编号：3403747
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