结核分枝杆菌差异区RD6基因Rvl515c促进胞内存活及其分子机理研究

发布时间：2017-05-03 01:03

  本文关键词：结核分枝杆菌差异区RD6基因Rvl515c促进胞内存活及其分子机理研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：由病原菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)引发的结核病依旧是一个全球范围内的健康难题,严重威胁着人类的生命健康,每年都有上百万人感染结核病。根据世界卫生组织的《全球结核病报告2014》年报指出：2013年新增结核病感染者900万例,其中死亡人数达到150万例,死于HIV共感染的人数36万。尽管结核病预防疫苗以及多种用于治疗结核病的药物不断研发和出现,但是随着多耐药性菌株和HIV共感染等出现,使得结核病的预防和治疗形式愈加严峻。结核分枝杆菌是典型的胞内寄生菌,依赖一系列的特异性毒力因子或者操纵子实现在宿主细胞内的增殖和持留。利用生物信息学分析,发现结核分枝杆菌H37Rv拥有16个特异性差异识别区(Mtb-specific regions of difference, RDs)不存在于牛结核分枝杆菌或卡介苗等菌株基因组中。RDs区域系统类型的出现对于研究结核分枝杆菌的流行病学和进化研究具有重要的意义。结核分枝杆菌H37Rv的ESX-1分泌系统的主要组分均定位在RD1区域,其中包括主要的毒力因子ESAT-6和CFP10。特异性的RDs区域通常具有重要的免疫原性,是临床诊断和细胞免疫检测的潜在靶点。结核分枝杆菌差异识别区6 (Regions of difference, RD6)一共包括11个基因：Rv1506c-Rv1516 c,包括3个糖代谢途径中的相关蛋白(GDP-D-甘露糖脱水酶GmdA、核苷酸差向异构酶EpiA、糖基转移酶Rv1516c)以及2个膜蛋白(Rv1508c和Rv1510)。其中,基因rvl515c编码一个功能未知的保守蛋白。目前,RD6基因rv1515c在分枝杆菌中的功能尚不清楚。为探索该基因在分枝杆菌中的功能,本研究以非致病性快生型模式菌株——耻垢分枝杆菌为研究对象,构建MS_Rv1515c基因重组菌株。本研究第一次阐述了RD6区域基因v1515c在分枝杆菌和宿主相互作用中的功能。实验研究证实,rv1515c能够增强耻垢分枝杆菌在体外的存活能力,并且可能通过影响脂肪酸的合成而引起一系列菌落表型发生改变,包括滑动能力、单菌落形态和生物膜的形成。在各种环境胁迫下维持基因组的稳定性是生物生存和繁殖的关键。在各种压力环境(H2O2、联氨、SDS和低pH值)下,重组耻垢分枝杆菌MS_Rv1515c均具有显著的生长优势。重组耻垢分枝杆菌感染不同巨噬细胞(RAW264.7和THP-1)后,我们利用RT-PCR技术进一步检测v1515是否能够引起相关细胞因子mRNA表达水平发生改变。实验结果显示,鼠源巨噬细胞RAW264.7中细胞因子IL-6和IL-10 mRNA表达水平较实验对照组显著下调表达(p0.05)。我们在人源巨噬细胞THP-1中得到了相似的结果。此外,TNF-a和caspase-1的mRNA表达水平较实验对照组亦显著下调。同时,重组耻垢分枝杆菌在两种不同巨噬细胞内的存活率均高于实验对照。综上所述,我们的实验结果表明Rv1515c蛋白是与结核分枝杆菌致病性相关的一种免疫微环境因子调控蛋白,增强结核分枝杆菌在各种压力环境以及胞内存的活率,参与宿主细胞因子的表达调控。我们推测Rv1515c蛋白是一种潜在的新型抗结核药物靶点。
【关键词】：结核分枝杆菌 RD6 Rv1515c 巨噬细胞 IL-6 IL-10
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第1章 综述12-18
• 1.1 引言12
• 1.2 结核分枝杆菌特异性基因组区域RDs12-13
• 1.3 潜在特异性抗原——RDs编码蛋白13-15
• 1.4 RDs在分枝杆菌致病性中的研究15-16
• 1.5 展望16-18
• 第2章 前言18-20
• 第3章 实验材料和方法20-36
• 3.1 实验材料20-23
• 3.1.1 实验菌株、载体和细胞20
• 3.1.2 主要试剂20
• 3.1.3 培养基和溶液的配制20-23
• 3.1.4 实验仪器设备23
• 3.2 实验方法23-36
• 3.2.1 引物的设计与合成23-24
• 3.2.2 目的基因的获得24
• 3.2.3 目的基因rv1515c的TA克隆24-25
• 3.2.4 大肠杆菌DH5a、BL21和JM109感受态制备及转化25
• 3.2.4.1 大肠杆菌感受态制备25
• 3.2.4.2 大肠杆菌的转化(热激法)25
• 3.2.5 Rv1515c重组蛋白的表达25-27
• 3.2.5.1 Rv1515c重组质粒的构建25-26
• 3.2.5.2 Rv1515c重组蛋白在大肠杆菌中的表达26-27
• 3.2.6 耻垢分枝杆菌感受态制备及转化27-28
• 3.2.6.1 耻垢分枝杆菌感受态制备27
• 3.2.6.2 耻垢分枝杆菌电转化27-28
• 3.2.7 重组蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达验证(Western blot)28-29
• 3.2.8 重组耻垢分枝杆菌菌落形态观察29
• 3.2.9 滑动实验29
• 3.2.10 耻垢分枝杆菌生物膜培养29
• 3.2.11 重组耻垢分枝杆菌脂肪酸分析29-30
• 3.2.12 重组耻垢分枝杆菌在营养饥饿条件以及酸性条件下的存活影响30
• 3.2.13 重组耻垢分枝杆菌对SDS耐受性检测30-31
• 3.2.14 重组耻垢分枝杆菌对氧化压力的影响31
• 3.2.15 重组耻垢分支杆菌侵染巨噬细胞(RAW264.7和THP-1)后胞内存活率及细胞因子检测31-36
• 3.2.15.1 巨噬细胞培养31-32
• 3.2.15.2 重组耻垢分枝杆菌菌悬液的制备32
• 3.2.15.3 重组耻垢分枝杆菌感染巨噬细胞32
• 3.2.15.4 重组耻垢分支杆菌感染巨噬细胞（RAW264.7和THP-1)后细胞因子检测32-36
• 第4章 结果与分析36-48
• 4.1 rv1515c目的基因扩增和鉴定36
• 4.2 成功构建Rv1515c大肠杆菌表达菌株36-37
• 4.3 Rv1515c重组蛋白在大肠杆菌BL21中成功表达37-38
• 4.4 成功构建重组耻垢分枝杆菌MS_Rv1515c38
• 4.5 重组耻垢分枝杆菌MS_Rv1515c菌落形态观察和生物膜形成38-39
• 4.6 Rv1515c对耻垢分枝杆菌生长无显著影响39-40
• 4.7 滑动实验40
• 4.8 重组耻垢分枝杆菌脂肪酸含量检测40-41
• 4.9 Rv1515c增强耻垢分枝杆菌在营养饥饿及酸性条件下的存活41-42
• 4.10 Rv1515c增强耻垢分枝杆菌对SDS的耐受42
• 4.11 Rv1515c增强耻垢分枝杆菌对H_2O_2的耐受42-43
• 4.12 Rv1515c增强耻垢分支杆菌对联氨的耐受43-44
• 4.14 Rv1515c增强耻垢分枝杆菌在RAW264.7巨噬细胞中存活44
• 4.15 Rv1515c引起RAW264.7巨噬细胞中细胞因子的变化44-45
• 4.16 Rv1515c增强耻垢分枝杆菌在THP-1巨噬细胞中存活45-46
• 4.17 Rv1515c引起THP-1巨噬细胞中细胞因子的变化46-48
• 第5章 结论与展望48-52
• 5.1 实验结论48
• 5.2 讨论与分析48-50
• 5.3 展望50-52
• 参考文献52-58
• 致谢58-60
• 在学期间所发表的文章60

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1 刘民强;结核分枝杆菌差异区RD6基因Rvl515c促进胞内存活及其分子机理研究[D];西南大学;2015年

  本文关键词：结核分枝杆菌差异区RD6基因Rvl515c促进胞内存活及其分子机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：342007