SAMP检测方法的条件优化及对HBV的检测研究
发布时间：2017-05-03 03:08
本文关键词：SAMP检测方法的条件优化及对HBV的检测研究，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：核酸扩增技术广泛地应用于痕量核酸的检测中。本论文主要是对本实验室构建的一种单引物引发的核酸等温扩增方法(Single Primer-triggered Isothermal Amplification for Double-stranded DNA detection, SAMP)进行条件优化,并利用此方法对实际样品乙型肝炎病毒(HBV)进行了检测研究。本论文采用正交试验法对聚合酶、切刻酶、引物用量以及反应温度进行优化,得到了最优的水平组合,聚合酶用量为0.05μL,切刻酶用量为0.4μL,引物浓度为5.0×10-7 M以及温度为55℃。然后,利用本方法在最优的条件下对质粒靶标进行了检测,结果显示该方法可检测到1.0×10-17 M,因此,该方法具有较好的检测限。本论文还采用了纳米金比色的方法对扩增结果进行了分析。SAMP体系反应35 min后,加入纳米金进行比色。结果显示,高浓度的靶标体系有着明显的颜色变化,而低浓度的靶标体系以及空白对照都没有发生颜色变化。因此,利用这种方式,我们可以实现目标的灵敏比色检测。最后,利用此方法在最优反应条件下对HBV实际样品进行检测,本方法针对中国常见的HBV-B型、HBV-C型以及HBV-D型这三种类型进行了引物设计并检测,其中HBV-D型的检测限可达到1.0×10-17M,可以和荧光定量PCR相媲美。另外,对于HBV-B型、HBV-C型的检测还需要进一步对引物进行优化,以期取得更好的灵敏度。
【关键词】：PCR 等温扩增 纳米金 比色检测 HBV检测
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q503;R373.21
【目录】：
- 摘要3-4
- ABSTRACT4-8
- 第一章 综述8-31
- 1.1 基于工具酶的DNA信号放大技术9-23
- 1.1.1 聚合酶链式反应扩增9-11
- 1.1.2 链置换扩增技术11-15
- 1.1.2.1 多重置换扩增11-13
- 1.1.2.2 切刻引发的链置换反应13-14
- 1.1.2.3 结构转化引发的链置换反应14-15
- 1.1.3 指数扩增反应技术15-16
- 1.1.4 滚环扩增技术16-18
- 1.1.5 环介导等温扩增技术18-21
- 1.1.6 基于核酸序列的扩增技术21-22
- 1.1.7 依赖于解旋酶等温基因扩增技术22-23
- 1.2 纳米金比色技术23-27
- 1.2.1 纳米金的性质23-24
- 1.2.2 纳米金的DNA修饰24-26
- 1.2.3 纳米金比色检测DNA26-27
- 1.3 乙型肝炎的概述27-29
- 1.3.1 乙型肝炎流行现状及危害27
- 1.3.2 乙型肝炎病毒的结构27-28
- 1.3.3 乙型肝炎病毒的基因组DNA结构及复制28-29
- 1.3.4 乙型肝炎目前的检测手段29
- 1.4 本论文的研究意义与主要内容29-31
- 第二章 SAMP检测方法条件的优化31-51
- 2.1 引言31-32
- 2.2 实验部分32-38
- 2.2.1 仪器与试剂32-33
- 2.2.2 PBS质粒DNA的提取及浓度的估计33-34
- 2.2.3 荧光定量检测34-35
- 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳35-36
- 2.2.4.1 琼脂糖凝胶电泳的原理35
- 2.2.4.2 琼脂糖凝胶电泳的制备35-36
- 2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳36-37
- 2.2.5.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理36
- 2.2.5.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备36-37
- 2.2.6 纳米金的合成与修饰37-38
- 2.2.6.1 纳米金的合成37-38
- 2.2.6.2 纳米金的修饰38
- 2.3 结果与讨论38-44
- 2.3.1 实验原理38-39
- 2.3.2 引物序列的设计39-41
- 2.3.3 PBS质粒的浓度估计41-42
- 2.3.4 荧光检测结果42
- 2.3.5 溶解曲线42-43
- 2.3.6 电泳结果分析43-44
- 2.4 正交试验优化实验条件44-48
- 2.4.1 反应程序设计图44-45
- 2.4.2 三组荧光定量检测结果45-48
- 2.5 纳米金比色检测结果48-50
- 2.6 小结50-51
- 第三章 SAMP方法在HBV检测中的应用51-61
- 3.1 引言51-52
- 3.2 实验部分52-55
- 3.2.1 仪器部分52
- 3.2.2 试剂部分52-53
- 3.2.3 HBV DNA的提取53-54
- 3.2.4 HBV DNA的浓度估计54
- 3.2.5 HBV DNA的实时荧光检测54-55
- 3.3 实验结果与讨论55-60
- 3.3.1 HBV DNA引物序列的设计55
- 3.3.2 HBV DNA的浓度的估计结果55-56
- 3.3.3 SAMP不同引物的荧光检测结果56-58
- 3.3.4 SAMP与荧光定量PCR的检测结果比较58
- 3.3.5 SAMP对HBV B型和C型基因的检测结果58-60
- 3.4 小结60-61
- 结论61-62
- 参考文献62-69
- 致谢69-70
- 攻读硕士学位期间发表的论文目录70-71
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本文编号：342204
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