鼠疫菌和志贺菌毒力大质粒对细菌蛋白表达谱的影响

发布时间：2017-05-03 03:15

  本文关键词：鼠疫菌和志贺菌毒力大质粒对细菌蛋白表达谱的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：志贺氏菌(Shigella),又称痢疾杆菌,是一类无鞭毛,不形成芽孢的革兰氏阴性杆菌,为人类细菌性痢疾的主要病原体。鼠疫耶尔森氏菌是一类有荚膜,无鞭毛,不形成芽孢的革兰氏阴性短杆菌,是鼠疫的病原菌。Ⅲ型分泌系统是某些革兰氏阴性病原菌所具有的一种特殊细胞结构,志贺氏菌和鼠疫耶尔森氏菌都具有Ⅲ型分泌系统结构,这种结构跨越病原细菌的内膜、外膜及宿主细胞膜。细菌内合成的蛋白质通过Ⅲ型分泌系统结构分泌到宿主细胞中,这些蛋白在病原菌侵袭宿主以及宿主致病过程中发挥重要作用。在这两种细菌中,Ⅲ型分泌系统的结构组成蛋白及效应分子,均由一类进化过程中外源获得的毒力大质粒编码。为了更好地研究外源毒力大质粒对细菌蛋白表达谱的影响及其共性和特性,本文拟对两种不同的病原菌进行对比分析。众所周知,细胞内的大多数蛋白通常要和其它蛋白相互结合并相互调节,最终形成蛋白复合物来行使其功能。非变性凝胶电泳(BN-PAGE),在分离蛋白质复合物的时候,能够保持蛋白的生物学活性。在蛋白复合物分离以及蛋白质和蛋白质相互作用等多个领域研究发挥了重要作用。本研究首先采用BN-PAGE方法从毒力编码Ⅲ型分泌系统质粒缺失突变株和野生株的全菌复合物蛋白及膜复合物蛋白的对比中,发现志贺氏菌的Ⅲ型分泌系统毒力质粒缺失与谷氨酸脱羧酶及ATP合成酶的复合物形成有关,而在鼠疫耶尔森氏菌中,并未发现此现象。随后,我们希望从蛋白质组水平分析鼠疫菌毒力大质粒对细菌表达谱的影响,并与福氏志贺氏菌中的类似研究进行对比,以期阐明两种细菌在毒力质粒表达调控中的异同。本研究通过双向电泳技术与质谱分析相结合的方法,比较了鼠疫缺失编码Ⅲ型分泌系统的质粒缺失菌株和野生株在26℃和37℃培养条件下的蛋白表达差异,成功分离并鉴定了鼠疫耶尔森氏菌野生株和毒力大质粒缺失突变株中的差异蛋白,其中26℃条件下鉴定到29个差异蛋白,37℃条件下鉴定到25个差异蛋白,其中包含7个由pCD1质粒编码的蛋白。但没有检测到与谷氨酸脱羧酶及ATP合成酶有关的蛋白表达变化。这些差异蛋白中仅有2个与志贺氏菌中的报道相符,说明两种细菌的基因调控模式存在显著差异。此外,针对前期研究发现的表达量受毒力大质粒调控的志贺氏菌谷氨酸脱羧酶,我们构建了相应的基因突变株并对其编码基因的调控进行了初步研究。由于谷氨酸脱羧酶存在两种同工酶,我们利用λ-Red重组系统分别构建了单缺失及双缺失基因突变株,为进一步研究同工酶的功能奠定了基础。同时利用磁珠捕获及质谱鉴定的方法,对谷氨酸脱羧酶可能的调控蛋白进行了初步分析。结果发现,除已报道的调控蛋白H-NS外,StpA、RuvA也可能参与了谷氨酸脱羧酶的调控。综上所述,志贺氏菌和鼠疫耶尔森氏菌都具有Ⅲ型分泌系统结构,Ⅲ型分泌系统结构在肠道和呼吸道致病菌中都是重要的毒力因子,本研究采用的缺失株和野生株的复合物和蛋白质组学研究,为毒力相关蛋白的筛选和蛋白功能研究提供了参考,也为今后开展蛋白质复合物研究奠定了基础。
【关键词】：鼠疫耶尔森氏菌 志贺氏菌 蛋白复合物 Ⅲ型分泌系统
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 文献综述10-16
• 1 病原微生物简介10
• 2 志贺氏菌简介10-12
• 2.1 志贺氏菌流行病学10
• 2.2 志贺氏菌的致病途径及机制10-11
• 2.3 志贺氏菌的抗酸机制11-12
• 2.4 志贺氏菌的毒力大质粒和Ⅲ型分泌系统12
• 3 鼠疫耶尔森氏菌简介12-14
• 3.1 鼠疫耶尔森氏菌的流行病学13
• 3.2 鼠疫耶尔森氏菌的致病途径及机制13
• 3.3 鼠疫耶尔森氏菌的pCD1质粒和Ⅲ型分泌系统13-14
• 4 BN-PAGE的简介14-15
• 5 本研究的目的与意义15-16
• 第一章 病原菌蛋白复合物研究16-24
• 1 材料及试剂耗材16-17
• 1.1 菌株16-17
• 1.2 仪器和试剂17
• 1.3 实验用溶液配制17
• 2 实验方法17-19
• 2.1 志贺氏菌全菌复合物蛋白样品制备17
• 2.2 志贺氏菌膜复合物蛋白样品制备17-18
• 2.3 BN-PAGE各成分胶的配制18
• 2.4 BN-PAGE分离复合物18
• 2.5 Western blot18-19
• 3 实验结果19-21
• 3.1 与ATP合成酶有关的复合物结果19-20
• 3.2 与IpaB毒力有关的复合物结果20
• 3.3 与谷氨酸脱羧酶GadB有关的复合物结果20-21
• 3.4 鼠疫耶尔森氏菌的复合物结果21
• 4 讨论与分析21-24
• 第二章 鼠疫菌201野生株和201△pCD1缺失突变株蛋白表达谱的比较研究24-35
• 1 材料与仪器试剂24
• 1.1 菌株24
• 1.2 主要化学试剂耗材和仪器24
• 1.3 常用溶液的配制24
• 2 实验方法24-26
• 2.1 双向电泳24-26
• 2.1.1 菌株培养24
• 2.1.2 全菌蛋白样品制备24-25
• 2.1.3 蛋白质样品纯化25
• 2.1.4 上样前处理纯化样品和水化25
• 2.1.5 等电聚焦25
• 2.1.6 胶条的平衡25-26
• 2.1.7 二向电泳26
• 2.1.8 染色及脱色26
• 2.1.9 图像扫描26
• 2.1.10 胶内酶切26
• 2.1.11 蛋白差异点的MALDI-TOF质谱检测26
• 2.1.12 数据库查询26
• 3 实验结果26-33
• 3.1 野生株与突变株双向电泳图谱27-28
• 3.2 201野生株与201△pCD1突变株差异蛋白质谱结果鉴定28-33
• 3.2.1 在26℃培养条件下201野生株和201△pCD1缺失突变株差异表达蛋白28-30
• 3.2.2 在37℃培养条件下201野生株和201△pCD1缺失突变株差异表达蛋白30-32
• 3.2.3 质粒编码的鼠疫毒力相关蛋白32-33
• 4 讨论33-35
• 第三章 301△gadA及301△gadA：：gadB缺失突变株构建及谷氨酸脱羧酶功能研究35-43
• 1 材料与仪器试剂35
• 1.1 菌株和载体35
• 1.2 仪器和试剂35
• 1.3 实验用的溶液配制35
• 2 实验方法35-39
• 2.1 301△gadA及301△gadA：：gadB缺失突变株构建35-38
• 2.1.1 引物设计35-36
• 2.1.2 线性打靶片段的构建36-37
• 2.1.3 301/pKOBEG和301△gadB/pKOBEG菌株的构建37
• 2.1.4 301 △gadA：：kan和301 AgadA-gadB：：kan突变株的构建37-38
• 2.1.5 抗性基因的去除38
• 2.2 301△gadA、301△gadB及301△gadA：：gadB缺失突变株双向电泳38
• 2.3 2457T野生株和2457T△hns突变株的磁珠捕获实验38-39
• 2.3.1 调控区DNA的获得38
• 2.3.2 调控区DNA与磁珠相互作用38-39
• 2.3.3 磁珠捕获相互作用蛋白39
• 2.3.4 相互作用蛋白双向电泳及质谱鉴定39
• 3 实验结果39-42
• 3.1 线性打靶片段的构建结果39
• 3.2 301△gadA：：kan和301 △gadA-gadB：：kan突变株的构建结果39-40
• 3.3 301野生株、301△gadA、301 △gadB及301 △gadA：：gadB缺失突变株双向电泳结果40-41
• 3.4 2457T野生株和2457T△hns突变株GadA/GadB相互作用蛋白磁珠捕获双向电泳结果41
• 3.5 2457T野生株和2457T△hns突变株GadA/GadB相互作用蛋白磁珠捕获质谱鉴定结果41-42
• 4 讨论42-43
• 总结和展望43-44
• 参考文献44-49
• 附录Ⅰ 各种试剂盒使用步骤49-51
• 附录Ⅱ 实验中所用仪器设备51-52
• 附录Ⅲ 实验中所用试剂52-54
• 附录Ⅳ 缩略词54
• 附录Ⅴ 实验中常用溶液配制54-57
• 致谢57

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本文编号：342242