MASP-2 CUB1和CUB2功能区蛋白抗体制备及初步鉴定

发布时间：2017-05-09 10:02

  本文关键词：MASP-2 CUB1和CUB2功能区蛋白抗体制备及初步鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：补体系统作为机体固有免疫防御的重要部分,是具有精密调控机制的蛋白质反应系统。而甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(mannan-binding lectin associated serine protease-2,MASP-2)作为激活补体凝集素途径的重要参与者,具有极为重要的生物学意义。MASP-2的缺乏或功能障碍可能导致长期性易发感染,与肿瘤和自身免疫性疾病的发生及发展也存在关联。机体在甘露聚糖结合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)识别并结合病原体后,激活补体凝集素途径。此时MASP-2分子中丝氨酸蛋白酶区域的精氨酸-异亮氨酸间的肽键裂解并产生自激活作用,进而引发后续反应。MASP-2分子由6个功能区片段组成,CUB结构域是在补体成分C1r/C1s、Uegf和骨髓多态形成蛋白(b?o?n?e??m?o?r?p?h?o?g?e?n?e?t?i?c protein 1,bmp1)中发现的结构域。CUB1-EGF与MASP-2同源二聚体形成相关,CUB1-EGF-CUB2与MBL结合相关,并决定其是否能够被活化。本实验拟在分别成功构建CUB1及CUB2原核重组表达载体的基础上,应用异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达融合蛋白,经纯化后免疫适龄雌性BALB/c小鼠,制备高特异性的多克隆抗体,以期为后续检测体液MASP-2含量、构建以多克隆抗体为基础的临床辅助诊断乃至治疗奠定基础。本实验将CUB1及CUB2基因片段通过PCR技术扩增所获得的产物经纯化后以BamH I、Not I进行双酶切,继而切胶回收,经DNA连接酶连接构建重组质粒pGEX-6P-2-CUB1及pGEX-6P-2-CUB2,分别将携带CUB1、CUB2基因片段的pGEX-6P-2重组质粒转化入E.coli BL21感受态细胞,并将菌液涂布于LB选择性固体培养基上筛选阳性克隆,获得的阳性克隆经过验证后取单一菌落接种于LB液体培养基中培养14~16小时。扩大培养至A600于0.8~1.0之间,加入IPTG诱导蛋白表达。离心后弃除上清液并充分洗涤菌体沉淀后,在冰浴条件下进行超声裂解,分别取裂解后上清液和沉淀制备样本进行SDS-PAGE,分析融合蛋白所在组分。GST-CUB1及GST-CUB2蛋白均以包涵体形式存在,利用高浓度尿素变性,梯度复性后纯化融合蛋白。将纯化后的融合蛋白作为抗原,与Freund佐剂充分混合后免疫5周龄BALB/c雌性小鼠,此后分别于第1天、第14天及第28天进行腹腔免疫注射,于末次免疫后一周后取血,分离血清后保存于-80℃环境。应用Western blot检测多克隆抗体特异性,应用间接酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测多克隆抗体效价:CUB1抗体效价达1∶32 000,CUB2抗体效价大于1∶16 000。通过本实验已分别获得效价高、特异性强的CUB1及CUB2多克隆抗体。
【关键词】：MASP-2 CUB1 CUB2 融合蛋白表达 多克隆抗体制备
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-13
• 前言13-15
• 实验仪器及材料15-20
• 实验方法与步骤20-32
• 结果32-34
• 附图34-42
• 附表42-43
• 讨论43-46
• 结论46-47
• 参考文献47-51
• 综述51-61
• 参考文献55-61
• 致谢61-62
• 个人简历62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 贾天军,李萍,张庶民;MASPs的结构与功能研究现状[J];医学综述;2003年04期

2 Yanping Shi;Geling Liu;Huiqin Zhang;Fang Yu;Xiuxiu Xiang;Yifang Lu;Xiaomei Dong;Xiaohua Li;;甲状腺肿瘤患者血清中MBL和MASP-2的表达水平及其意义(英文)[J];The Chinese-German Journal of Clinical Oncology;2013年03期

  本文关键词：MASP-2 CUB1和CUB2功能区蛋白抗体制备及初步鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：352260