人乙醛脱氢酶2的密码子优化及分子克隆
发布时间：2021-11-27 18:41
乙醛脱氢酶（ALDH）是参与人体酒精代谢的关键酶之一,ALDH是一个庞大的蛋白质家族,其中能够参与酒精代谢的主要是位于肝脏线粒体的ALDH2。ALDH2可将酒精代谢过程中产生的乙醛转化为乙酸,从而减轻乙醛的毒害作用。但是很多人缺乏正常的ALDH2,易引起酒精中毒。近年来,随着人们健康意识的提高,对解酒护肝药物和制剂的需求越来越明显,因而对ALDH2的研究更显得意义深远。目前商业化的ALDH2主要从动物肝脏或肝细胞线粒体中提取,价格昂贵,难以大规模生产。本课题旨在采用基因工程的方法构建原核表达载体,导入到大肠杆菌中,利用微生物发酵大量制备ALDH2,并通过密码子优化,提高重组ALDH2的表达量。具体研究如下:1、从肝癌细胞中提取总RNA,反转录得到cDNA,然后PCR扩增获得Aldh2片段,并将回收产物连接至pMD19-T-simple载体,转化五.cCliDH5α,抽提重组质粒进行双酶切鉴定并测序,以确保目的基因连接至克隆载体,同源比对分析显示序列同源性为100%。用限制性核酸内切酶EcoR I和Mde I将质粒pMD19-T-ALDH2中的目的基因切下,亚克隆至同样双酶切的线性化质粒...
【文章来源】：浙江工商大学浙江省
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
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基于此类研宄，对ｄ／办２进行密码子优化，以期提高该基因在大肠杆菌中的表达??水平。密码子适应指数（ＣＡＩ）指的是编码区同义密码子与最佳密码子使用频率的??相符程度，取值范围是０？１，数值越大代表基因的表达水平越高［７３］。从图３－１可??以看出优化前基因的ＣＡＩ为０．７３，而优化后的ＣＡＩ达到０．９６，明显高于优化前，??并且ＣＡＩ数值接近于１，己经达到了较高的水平。??Ｃｏｄｏｎ?Ｉ＇ｓｅｇｅ?Ａｄｊｕｓｔ??ｉｊｌｌｌｌｌｌＵＪｌｌｊ＾??ＣＡＩ?，０．７３?Ｒｅｌａｔｉｖｅ?Ｃｏｄｏｎ??Ｃｏｄｏｎ?ｌ?ｓｅｇｅ?Ａｄｊｕｓｔ??Ｓ?Ｓ?５?§?５?５?２?Ｍ?§?５?Ｍ?Ｉ?３?ｓ?３?５?３?Ｓ?３?Ｍ?Ｍ?§?ｇ?５?§?Ｈ?ｇ？?２?２?３??Ｃ＇ＡＩ?＊０?９６?Ｒｅｌａｔｉｖｅ?Ｃｏｄｏｎ??图３－１优化前（Ａ）后（Ｂ）密码子适应指数（ＣＡＩ）的对比??Ｆｉｇ．３－１?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｃｏｄｏｎ?ａｄａｐｔａｔｉｏｎ?ｉｎｄｅｘ?（ＣＡＩ）?ｂｅｆｏｒｅ?（Ａ）ａｎｄ?ａｆｔｅｒ（Ｂ）??ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ??３．３．２．２?ＧＣ含置分析??ＧＣ含量会影响ＤＮＡ密度，影响ＤＮＡ变性的难易程度。ＧＣ含量的理想百??分比范围在３０％？７０％之间
【参考文献】：
期刊论文
[1]乙醛脱氢酶的克隆表达及其酶学性质[J]. 豆欣喜,张明,林材,吴殿辉,李晓敏,孙军勇,蔡国林,陆健. 食品与发酵工业. 2018(04)
[2]金黄色葡萄球菌α-溶血素的克隆及可溶性融合表达[J]. 吴桐,徐文峰,年四季,叶迎春,袁青. 中国免疫学杂志. 2016(04)
[3]原核表达的人乙醛脱氢酶2（ALDH2）的活性及稳定性研究[J]. 王荷花,潘博宇,黄娟,陈孝平,吴元欣. 氨基酸和生物资源. 2015(04)
[4]人乙醛脱氢酶2的原核表达及条件的优化[J]. 黄娟,张小骥,刘传青,向玲娟,陈孝平,吴元欣. 化学与生物工程. 2014(06)
[5]大肠杆菌外源蛋白表达载体稳定性的研究进展[J]. 江伟华,刘益丽,江明锋. 生物技术通报. 2014(05)
[6]假坚强芽胞杆菌中乙醇降解相关酶的克隆、表达及酶学特性[J]. 鞠建松,马宁,赵冉冉,刘景伟,徐书景,赵宝华. 微生物学报. 2013(04)
[7]乙醛脱氢酶2基因多态性与脑梗死患者颈动脉粥样硬化斑块形成的相关性[J]. 孙华林. 山东大学学报(医学版). 2012(07)
[8]低温诱导堆型艾美耳球虫3-1E基因的可溶性表达[J]. 姚鹏,张建军,王黎霞,安健. 北京农学院学报. 2012(02)
[9]Relationship between genetic polymorphisms of ALDH2 and ADH1B and esophageal cancer risk:A meta-analysis[J]. Akira Yokoyama,Tetsuji Yokoyama. World Journal of Gastroenterology. 2010(33)
[10]大肠杆菌表达系统的影响因素[J]. 许崇利,杨梅,许崇波. 中国动物检疫. 2010(08)
硕士论文
[1]酶法不对称合成（3R,5R）-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯[D]. 刘玉婷.浙江大学 2017
[2]人乙醛脱氢酶2的表达及其在缓解小鼠急性酒精中毒中的研究[D]. 黄锟.武汉工程大学 2010
本文编号：3522840
【文章来源】：浙江工商大学浙江省
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－１?ＡＬＤＨ２?ＰＣＲ扩增产物??Ｍ：?ＤＳ?５０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１－３：?ＡＬＤＨ２?ＰＣＲ?产物??
ＴＵＭＵ?丨（４６０丨＾ＨｃｏＮＩ（Ｍ２７）??Ｈｐａ?ｌｏｔ?（３９６２）?里龙應??图２－３重组表达质粒ｐＥＴ４４ｂ－ＡＬＤＨ２的构建??Ｆｉｇ．?２－３?Ｔｈｅ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＥＴ４４ｂ－ＡＬＤＨ２??２．３．４．２?ｐＥＴ４４ｂ－ＡＬＤＨ２?酶切鉴定??ｐＭＤ１９－Ｔ－ＡＬＤＨ２?经?ＡＷｅ?Ｉ、￡ｃｏ／？?１?双酶切后回收?片段（图?２－４?的?１、２??泳道），克隆入同样经ＡＷｅ?Ｉ、五ｃｏ／Ｍ双酶切处理的质粒ｐＥＴ４４ｂ⑴中（图２－４的３、??４泳道，转化五．ｃｏ／／ＢＬ２１（ＤＥ３）。３７°Ｃ倒置培养１６？２０ｈ，用接种环挑取单菌落??接种于５?ｍＬ含Ａｍｐ的ＬＢ培养基。抽提重组质粒ｐＥＴ４４ｂ－ＡＬＤＨ２，然后用??Ｉ、五ｏ＾Ｉ双酶切鉴定，酶切产物跑１％琼脂糖凝胶电泳进行分离，如图２－４（Ｂ）??所示在５６００ｂｐ和１５００ｂｐ处各有一条条带，得到与预期片段大小一致的线性化质??粒ｐＥＴ４４ｂ（＋）和ＡＬＤＨ２的目的基因片段，表明」碰２片段已成功克隆到ｐＥＴ４４ｂ（＋）??表达载体中。??２５??
基于此类研宄，对ｄ／办２进行密码子优化，以期提高该基因在大肠杆菌中的表达??水平。密码子适应指数（ＣＡＩ）指的是编码区同义密码子与最佳密码子使用频率的??相符程度，取值范围是０？１，数值越大代表基因的表达水平越高［７３］。从图３－１可??以看出优化前基因的ＣＡＩ为０．７３，而优化后的ＣＡＩ达到０．９６，明显高于优化前，??并且ＣＡＩ数值接近于１，己经达到了较高的水平。??Ｃｏｄｏｎ?Ｉ＇ｓｅｇｅ?Ａｄｊｕｓｔ??ｉｊｌｌｌｌｌｌＵＪｌｌｊ＾??ＣＡＩ?，０．７３?Ｒｅｌａｔｉｖｅ?Ｃｏｄｏｎ??Ｃｏｄｏｎ?ｌ?ｓｅｇｅ?Ａｄｊｕｓｔ??Ｓ?Ｓ?５?§?５?５?２?Ｍ?§?５?Ｍ?Ｉ?３?ｓ?３?５?３?Ｓ?３?Ｍ?Ｍ?§?ｇ?５?§?Ｈ?ｇ？?２?２?３??Ｃ＇ＡＩ?＊０?９６?Ｒｅｌａｔｉｖｅ?Ｃｏｄｏｎ??图３－１优化前（Ａ）后（Ｂ）密码子适应指数（ＣＡＩ）的对比??Ｆｉｇ．３－１?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｃｏｄｏｎ?ａｄａｐｔａｔｉｏｎ?ｉｎｄｅｘ?（ＣＡＩ）?ｂｅｆｏｒｅ?（Ａ）ａｎｄ?ａｆｔｅｒ（Ｂ）??ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ??３．３．２．２?ＧＣ含置分析??ＧＣ含量会影响ＤＮＡ密度，影响ＤＮＡ变性的难易程度。ＧＣ含量的理想百??分比范围在３０％？７０％之间
【参考文献】：
期刊论文
[1]乙醛脱氢酶的克隆表达及其酶学性质[J]. 豆欣喜,张明,林材,吴殿辉,李晓敏,孙军勇,蔡国林,陆健. 食品与发酵工业. 2018(04)
[2]金黄色葡萄球菌α-溶血素的克隆及可溶性融合表达[J]. 吴桐,徐文峰,年四季,叶迎春,袁青. 中国免疫学杂志. 2016(04)
[3]原核表达的人乙醛脱氢酶2（ALDH2）的活性及稳定性研究[J]. 王荷花,潘博宇,黄娟,陈孝平,吴元欣. 氨基酸和生物资源. 2015(04)
[4]人乙醛脱氢酶2的原核表达及条件的优化[J]. 黄娟,张小骥,刘传青,向玲娟,陈孝平,吴元欣. 化学与生物工程. 2014(06)
[5]大肠杆菌外源蛋白表达载体稳定性的研究进展[J]. 江伟华,刘益丽,江明锋. 生物技术通报. 2014(05)
[6]假坚强芽胞杆菌中乙醇降解相关酶的克隆、表达及酶学特性[J]. 鞠建松,马宁,赵冉冉,刘景伟,徐书景,赵宝华. 微生物学报. 2013(04)
[7]乙醛脱氢酶2基因多态性与脑梗死患者颈动脉粥样硬化斑块形成的相关性[J]. 孙华林. 山东大学学报(医学版). 2012(07)
[8]低温诱导堆型艾美耳球虫3-1E基因的可溶性表达[J]. 姚鹏,张建军,王黎霞,安健. 北京农学院学报. 2012(02)
[9]Relationship between genetic polymorphisms of ALDH2 and ADH1B and esophageal cancer risk:A meta-analysis[J]. Akira Yokoyama,Tetsuji Yokoyama. World Journal of Gastroenterology. 2010(33)
[10]大肠杆菌表达系统的影响因素[J]. 许崇利,杨梅,许崇波. 中国动物检疫. 2010(08)
硕士论文
[1]酶法不对称合成（3R,5R）-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯[D]. 刘玉婷.浙江大学 2017
[2]人乙醛脱氢酶2的表达及其在缓解小鼠急性酒精中毒中的研究[D]. 黄锟.武汉工程大学 2010
本文编号：3522840
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