小鼠及猕猴胚胎MECP2基因T158M单碱基突变体系的建立

发布时间：2021-11-28 00:17

　　目的:利用单碱基编辑技术定点修饰MECP2基因T158M位点,获得单一定点突变类型的啮齿类及非人灵长类胚胎,为建立模拟临床上Rett综合征的疾病动物模型奠定基础。方法:利用单碱基编辑技术构建3对T158M-sgRNA质粒,并分别与BE系统（BE3或BE4max）质粒共转染293T细胞筛选高效的sgRNA,通过显微注射将体外转录的mRNA以不同的浓度组合注射到ICR小鼠和猕猴受精卵中,检测小鼠和猕猴胚胎发育率和编辑效率,评估BE3和BE4max的工作效率及最优浓度组合。结果:小鼠胚胎上BE4max（ng/μl）∶sgRNA（ng/μl）=100∶50浓度组合时,小鼠胚胎发育率和编辑效率最佳,同时该浓度组合在猕猴胚胎上也获得了有效编辑效率。结论:成功在小鼠及猕猴胚胎上实现了MECP2基因T158M位点上C→T的转变,为后期建立T158M突变的RTT动物模型建立了稳定的胚胎编辑体系。 

【文章来源】：中国生物工程杂志. 2020,40(06)北大核心CSCD

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

sgRNA质粒构建

为了探究BE质粒和sgRNA的mRNA最佳浓度以及质量控制后mRNA对胚胎发育的稳定性，选取了小鼠胚胎作为实验对象，共用了4个浓度组合(BE4maxP2A-GFP∶T158M-sgRNA=20∶10、50∶20、100∶50和200∶100)，进行了3次重复，结果表明不同注射浓度对胚胎发育率和编辑效率影响不同。低浓度组合(BE4max-P2A-GFP∶T158M-sgRNA=20∶10、50∶20)囊胚发育率较高，但统计发现被编辑的胚胎个数少，突变率(指通过Sanger测序分析胚胎是100%纯合突变还是嵌合体，嵌合突变的比例)低。浓度组合为200∶100时，突变率高而囊胚率较低。综上结果，筛选了100∶50为胚胎注射的最优组合(表5)，运用T7酶切和Sanger测序的方法测定编辑后胚胎基因组序列并观察基因测序峰图(图3)，发现在设计的sgRNA序列PAM位点(从5"～3")第5个和第7个碱基出现了C→T的突变，第5个碱基由C→T，基因序列由TTC变成TTT，由于密码子的简并性，并没有改变氨基酸的类型，依然为苯丙氨酸，而第7个碱基由C→T的突变，引起了氨基酸由苏氨酸改变为甲硫氨酸，说明了BE基因编辑系统实现了准确的定点突变。图3 小鼠胚胎验证

小鼠胚胎验证

【参考文献】：
期刊论文
[1]基因编辑之“新宠”—单碱基基因组编辑系统[J]. 魏瑜,张晓辉,李大力.  遗传. 2017(12)



本文编号：3523310