组蛋白去甲基化酶KDM4A调控骨髓基质干细胞成脂/成骨分化的作用和机制研究
发布时间：2021-12-30 20:51
目的骨髓基质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞的定向分化成平衡关系,一旦平衡被打破会导致骨代谢相关疾病的发生。骨髓基质干细胞分化具有很复杂的分子机制,涉及到多个相关基因和信号通路的作用。近年来的研究发现表观遗传调控也参与到骨髓基质干细胞分化调控中并发挥了重要的作用,但具体机制尚未研究清楚。本研究选取组蛋白去甲基化酶KDM4A（lysine-specific demethylase4A）作为研究对象,分别从功能、机制和动物实验深入探讨其对骨髓基质干细胞分化的调控作用及相关分子机制。方法1、实时荧光PCR（q RT-PCR）检测小鼠各个组织中Kdm4a的m RNA表达水平;分离并培养小鼠原代骨髓基质中的干细胞,进行成骨和成脂诱导分化,检测Kdm4a在成脂和成骨分化过程的表达差异。在骨髓基质干细胞系ST2和原代骨髓基质干细胞中升高或降低Kdm4a的表达水平,利用q RT-PCR、Western blotting检测成骨和成脂相关基因在诱导后的表达变化,采用油红O染色和碱性磷酸酶染色观察KDM4A对细胞分化状态的影响。构建Kdm4a酶活性突变质粒观察丧失酶活性后KDM4A对细胞分化调控的改变。筛选KD...
【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校
【文章页数】：136 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
plvx-shRNA2质粒图谱
大学博士学位论文 KDM4A 对骨髓基质干细胞定向分化的果dm4a 在小鼠不同组织中的相对表达取 6 周龄 C57BL/6J 小鼠各组织的 mRNA，采用 qRT-PCR 方法检dm4a 的表达变化。结果如图 1.2 所示，Kdm4a 在骨和骨骼肌中高、肾和脑中表达量适中，在肝、肺、脾、结肠、腹股沟脂肪、附肪和肾周脂肪中表达量较低。以 Kdm4a 表达量最低的小肠组织作骼肌的表达量是在小肠中表达量的 88.9、42.5 倍。
图 1.3 Kdm4a 在小鼠原代骨髓基质干细胞成脂和成骨分化过程中的 mRNA 表达变化A 图：Adipogenic 为成脂诱导，B 图：Osteogenic 为成骨诱导* p<0.05 vs.诱导 0d。1.2.3 Kdm4a 过表达质粒和突变型质粒对 ST2 细胞成脂和成骨分化的影响1.2.3.1 Kdm4a 突变型质粒的构建根据 NCBI 获得 Kdm4a 的基因序列，找到酶活性位点，分别将肽链上第 133位，138 位，165 位和 170 位的 G 突变为 A，设计合成诱变引物。因为突变位点之间不连续，因此设计两对突变引物（在每个待突变位点处设计部分反向互补的引物对，每对正反向引物 5’端包含 15-21bp 反向互补区域），以野生型 Kdm4a质粒作为模板进行 PCR 扩增。两对突变引物分别扩增出两个片段，DpnI 酶消化PCR 产物后切胶回收。两个片段通过同源重组连接，转化，提取质粒即为 Kdm4a突变型质粒（命名为 Kdm4a-Mut 质粒），经生物公司鉴定正确，在菌液中加入冻
【参考文献】：
期刊论文
[1]Lysine-specific demethylase 1 inhibitor rescues the osteogenic ability of mesenchymal stem cells under osteoporotic conditions by modulating H3K4 methylation[J]. Longwei Lv,Wenshu Ge,Yunsong Liu,Guanyou Lai,Hao Liu,Wenyue Li,Yongsheng Zhou. Bone Research. 2016(04)
本文编号：3558942
【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校
【文章页数】：136 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
plvx-shRNA2质粒图谱
大学博士学位论文 KDM4A 对骨髓基质干细胞定向分化的果dm4a 在小鼠不同组织中的相对表达取 6 周龄 C57BL/6J 小鼠各组织的 mRNA，采用 qRT-PCR 方法检dm4a 的表达变化。结果如图 1.2 所示，Kdm4a 在骨和骨骼肌中高、肾和脑中表达量适中，在肝、肺、脾、结肠、腹股沟脂肪、附肪和肾周脂肪中表达量较低。以 Kdm4a 表达量最低的小肠组织作骼肌的表达量是在小肠中表达量的 88.9、42.5 倍。
图 1.3 Kdm4a 在小鼠原代骨髓基质干细胞成脂和成骨分化过程中的 mRNA 表达变化A 图：Adipogenic 为成脂诱导，B 图：Osteogenic 为成骨诱导* p<0.05 vs.诱导 0d。1.2.3 Kdm4a 过表达质粒和突变型质粒对 ST2 细胞成脂和成骨分化的影响1.2.3.1 Kdm4a 突变型质粒的构建根据 NCBI 获得 Kdm4a 的基因序列，找到酶活性位点，分别将肽链上第 133位，138 位，165 位和 170 位的 G 突变为 A，设计合成诱变引物。因为突变位点之间不连续，因此设计两对突变引物（在每个待突变位点处设计部分反向互补的引物对，每对正反向引物 5’端包含 15-21bp 反向互补区域），以野生型 Kdm4a质粒作为模板进行 PCR 扩增。两对突变引物分别扩增出两个片段，DpnI 酶消化PCR 产物后切胶回收。两个片段通过同源重组连接，转化，提取质粒即为 Kdm4a突变型质粒（命名为 Kdm4a-Mut 质粒），经生物公司鉴定正确，在菌液中加入冻
【参考文献】：
期刊论文
[1]Lysine-specific demethylase 1 inhibitor rescues the osteogenic ability of mesenchymal stem cells under osteoporotic conditions by modulating H3K4 methylation[J]. Longwei Lv,Wenshu Ge,Yunsong Liu,Guanyou Lai,Hao Liu,Wenyue Li,Yongsheng Zhou. Bone Research. 2016(04)
本文编号：3558942
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