Zmp1的克隆表达及其对巨噬细胞的影响

发布时间：2017-05-12 00:03

  本文关键词：Zmp1的克隆表达及其对巨噬细胞的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目 的：构建分枝杆菌锌离子依赖的金属蛋白酶1(zmp1)基因的原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对Zmp1重组融合蛋白进行纯化；构建分枝杆菌zmpl基因与增强型的绿色荧光蛋白(EGFP)融合的真核表达载体,验证其在RAW264.7细胞中的表达；探讨Zmpl蛋白对RAW264.7细胞的增殖活性、细胞周期、细胞凋亡以及吞噬体-溶酶体融合的影响。方法：1.以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,采用PCR法扩增zmp1基因；定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达载体pET-32a(+)-zmpl；转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,纯化获取Zmpl重组蛋白,表达产物经SDS-PAGE和Westernblot鉴定。2.以BCG基因组DNA为模板,采用PCR法扩增zmp1基因；定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点中,构建重组真核表达载体p EGFP-N1-zmpl,并转染RAW264.7细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,实时定量PCR(qRT-PCR)检测zmpl基因mRNA的表达水平。3.用Zmpl重组蛋白作用RAW264.7细胞后24h, CCK-8法检测细胞的增殖活力；作用后48 h,流式细胞仪检测细胞的周期和凋亡4.将载体pEGFP-N1-zmpl瞬时转染RAW264.7细胞后24h,CCK-8法检测细胞的增殖活力；转染后48 h,流式细胞仪检测细胞的周期和凋亡。5.减毒鼠伤寒沙门氏菌(SL7207)感染RAW264.7细胞(已转染载体pEGFP-N1-Zmpl或Zmpl重组蛋白作用),采用沙门氏菌荧光抗体和溶酶体相关膜蛋白标志物荧光抗体双标记,通过荧光显微镜观察Zmpl蛋白阻止吞噬体-溶酶体融合的作用。结果：1.PCR法扩增出zmp1基因；定向克隆构建的原核表达载体pET一32a(+)-zmpl经双酶切及基因测序鉴定构建正确；经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出重组Zmpl融合蛋白,相对分子量约为94 kDa,大小与预期融合蛋白相符；Western blot结果显示重组Zmpl融合蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合。2.PCR法扩增出zmp1基因；定向克隆构建的真核表达载体pEGFP-N1-zmpl,经双酶切及基因测序鉴定构建正确；质粒转染的RAW264.7细胞中观察到绿色荧光表达；qRT-PCR结果显示转染pEGFP-N1-zmpl的RAW264.7田胞zmp1的表达显著升高。3.采用Zmpl重组蛋白细胞外作用RAW264.7细胞,在24-96 h观察到细胞增殖活力有所下降；细胞周期在S期被阻滞；早期细胞凋亡率和晚期细胞凋亡率均有所增加。4.将载体pEGFP-N1-zmpl转染RAW264.7细胞,在48～96 h观察到细胞增殖活力有所下降；细胞周期在S期和G2期被阻滞；早期细胞凋亡率有所增加。5.Zmpl重组蛋白组和pEGFP-N1-zmpl细胞转染组,双荧光融合数量变化不大,影响吞噬体-溶酶体融合差异不明显。结论：1.成功构建了zmpl基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组Zmpl融合蛋白表达。2.成功构建了zmp1基因真核表达载体,并在RAW264.7细胞中获得重组Zmpl融合蛋白表达。3.Zmp1蛋白能够抑制RAW264.7细胞的增殖活性、细胞周期、细胞凋亡,影响吞噬体-溶酶体融合效果不明显,为重组BCG疫苗的开发奠定基础。
【关键词】：Zmp1 增殖 凋亡 吞噬体一溶酶体 RAW264.7细胞
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 英汉缩略词名词对照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 第一部分 zmp1基因原核表达载体构建及表达鉴定15-30
• 1 材料与方法15-26
• 2 实验结果26-28
• 3 讨论28-29
• 4 小结29-30
• 第二部分 zmp1基因真核表达载体构建及在巨噬细胞中表达30-41
• 1 材料与方法30-37
• 2 实验结果37-39
• 3 讨论39-40
• 4 小结40-41
• 第三部分 Zmp1对巨噬细胞影响的初步研究41-52
• 1 材料与方法41-45
• 2 实验结果45-48
• 3 讨论48-51
• 4 小结51-52
• 全文小结52-54
• 参考文献54-59
• 文献综述59-69
• 参考文献64-69
• 致谢69-70
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文70

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