恶性疟原虫中含EEP结构域的DNase的表达与功能鉴定

发布时间：2017-05-12 11:16

  本文关键词：恶性疟原虫中含EEP结构域的DNase的表达与功能鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：疟疾依然是世界范围内重要的公共卫生问题之一,每年超过100万人死于疟疾,其中大部分为五岁以下的儿童。疟疾的病原体是疟原虫,是一种营寄生生活的原虫。在人体内无性生殖阶段中,疟原虫大量复制和反复入侵红细胞造成了疟疾的发病。脱氧核糖核酸酶(DNase)是参与生物体DNA复制、修复和重组等生理活动的重要蛋白质,同时也在病原体免疫逃避过程中发挥重要功能。EEP结构域能够水解DNA中的磷酸二酯键,是DNase降解DNA发挥功能的结构域之一。恶性疟原虫PF3D7_1238600、PF3D7_0107200、PF3D7_0305600、PF3D7_0319200和PF3D7_1363500蛋白质预测含有EEP结构域,且未见相关研究报道。首先,以Seryl-t RNA合成酶基因为内参基因,利用荧光定量PCR技术分析了PF3D7_1238600、PF3D7_0107200、PF3D7_0305600、PF3D7_1363500和PF3D7_0319200基因在恶性疟原虫3D7株红细胞内期不同发育阶段的转录情况,并比较了目的基因之间的转录水平。结果显示目的基因在恶性疟原虫3D7株整个红内期全程转录,并在滋养体和裂殖体期达到高峰;目的基因间转录差异较大,其中PF3D7_1238600基因整体转录水平最高,PF3D7_0107200基因整体转录水平最低。然后,通过对目的DNase氨基酸序列的亲水性分析,选取亲水好的区域进行重组蛋白质的原核表达与纯化,并免疫家兔制备多克隆抗体。以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blot检测虫体天然蛋白的表达,用间接免疫荧光对虫体天然蛋白质进行定位。结果显示,目的DNase在恶性疟原虫3D7株红细胞内期均有表达。间接免疫荧光分析显示,PF3D7_0319200蛋白质定位于细胞核,PF3D7_1238600、PF3D7_0305600和PF3D7_1363500蛋白质定位于细胞核周围,PF3D7_0107200蛋白质定位于细胞质。进一步将目的DNase的EEP结构域进行原核表达,进行体外DNA降解实验以确定其DNase活性。结果显示,PF3D7_1363500和PF3D7_0107200蛋白质为非金属离子依赖性脱氧核糖核酸内切酶,PF3D7_0305600和PF3D7_0319200蛋白质为Mg2+/Mn2+依赖性脱氧核酸酶内切酶,PF3D7_1238600蛋白质为Cu2+依赖性脱氧核糖核酸酶外切酶。本研究通过对目的DNase的转录、表达、亚细胞定位和功能的鉴定,为揭示目的DNase在疟原虫体内的功能和疟疾的治疗奠定基础。
【关键词】：恶性疟原虫 DNase EEP结构域 DNA降解
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R382.31
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一篇 文献综述12-19
• 第1章 疟原虫的脱氧核糖核酸酶的研究12-19
• 1.1 疟疾概述12-13
• 1.2 脱氧核糖核酸酶13-15
• 1.3 疟原虫中的脱氧核糖核酸酶15-18
• 展望18-19
• 第二篇 研究内容19-62
• 第1章 荧光定量PCR分析目的DNase基因在恶性疟原虫3D7株红内期的转录规律19-28
• 1.1 材料19-20
• 1.2 方法20-24
• 1.3 结果24-26
• 1.4 讨论26-27
• 1.5 小结27-28
• 第2章 目的DNase重组蛋白质的表达纯化和多克隆抗体的制备28-45
• 2.1 材料28-31
• 2.2 方法31-37
• 2.3 结果37-43
• 2.4 讨论43-44
• 2.5 小结44-45
• 第3章 恶性疟原虫3D7株目的DNase在红内期的表达和定位45-51
• 3.1 材料45-46
• 3.2 方法46-47
• 3.3 结果47-49
• 3.4 讨论49-50
• 3.5 小结50-51
• 第4章 恶性疟原虫3D7株目的DNase的功能鉴定51-62
• 4.1 材料51-52
• 4.2 方法52-54
• 4.3 结果54-60
• 4.4 讨论60-61
• 4.5 小结61-62
• 结论62-63
• 参考文献63-71
• 攻读硕士期间发表的论文71-72
• 导师简介72-73
• 作者简介73-74
• 致谢74

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