RNAi对旋毛虫丝氨酸蛋白酶1.2及丝氨酸蛋白酶抑制因子基因功能的研究

发布时间：2022-12-10 07:07

　　旋毛虫是一种主要的食源性寄生线虫,旋毛虫病主要是由于生食或半生食含旋毛虫囊包的肉制品从而感染。旋毛虫成虫寄生在宿主的小肠内,但幼虫侵入肠黏膜的机制尚不完全清楚。蛋白酶能够催化蛋白质多肽链的水解,而在寄生虫体内分泌的有多种功能的蛋白酶,在寄生虫的侵入与致病过程有着重要的作用。旋毛虫丝氨酸蛋白酶Ts SP1.2和丝氨酸抑制因子Ts SPI是从旋毛虫排泄-分泌物（excretory-secretory,ES）中获得的。实验室前期已经发现Ts SP1.2（Gen Bank Accession No.:EU302800）和Ts SPI抑制因子（Gen Bank accession no.XP₀03377380.1）均可能参与了旋毛虫感染性幼虫侵入小肠上皮细胞（IEC）。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指在生物进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA,ds RNA）诱发的、同源m RNA高效特异性降解的现象[1]。本研究的目的是通过RNAi确定Ts SP1.2和Ts SPI在旋毛虫幼虫侵袭和生长发育中的作用。将特异性... 

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
英文缩略词表(Abbreviations)
1 前言
    1.1 旋毛虫与旋毛虫病
    1.2 RNA干扰技术
    1.3 TsSP1.2的研究
    1.4 TsSPI基因
    1.5 研究意义
2 材料
    2.1 主要试剂
    2.2 主要仪器
    2.3 实验动物、旋毛虫虫种及所用细胞
    2.4 主要试剂的配制
3 方法
    3.1 技术路线
    3.2 菌种的活化,蛋白的诱导表达
    3.3 蛋白的纯化
    3.4 纯化蛋白的浓度测定
    3.5 ELASA法检测蛋白抗血清的效价
    3.6 siRNA的设计和合成
    3.7 虫体可溶的提取
    3.8 Weastern blot
    3.9 提取旋毛虫肌幼虫RNA
    3.10 RNA反转录样本cDNA
    3.11 RT-PCR验证c DNA质量
    3.12 Real-time PCR
    3.13 RNAi的基因特异性
    3.14 RNAi后旋毛虫肌幼虫在体外的存活率
    3.15 RNAi后对侵入IECs的影响
    3.16 RNAi对于旋毛虫肌幼虫侵入肠粘膜及其发育影响
    3.17 数据处理
4 结果
    4.1 应用RNAi对TsSP1.2蛋白的研究
        4.1.1 siRNA的设计合成
        4.1.2 siRNA转染到旋毛虫肌幼虫体内
        4.1.3 qPCR验证si RNA对TsSP1.2基因转录水平的影响
        4.1.4 Western blotting蛋白水平检测RNAi对TsSP1.2表达量变化
        4.1.5 TsSP1.2基因沉默后肌幼虫体外存活及侵入IECs情况
        4.1.6 TsSP1.2基因沉默后对肌幼虫侵入肠粘膜、发育及雌虫生殖力的影响
        4.1.7 siRNA-534处理后对各虫期虫体形态大小的影响
        4.1.8 RNAi的基因特异性
    4.2 应用RNAi对TsSPI蛋白的研究
        4.2.1 siRNA的设计合成
        4.2.2 siRNA转染到旋毛虫肌幼虫体内
        4.2.3 qPCR验证RNAi对TsSPI转录水平的影响
        4.2.4 Western blotting验证si RNA对TsSPI蛋白水平的表达量变化
        4.2.5 TsSPI基因沉默后肌幼虫体外存活及侵入IECs
        4.2.6 TsSPI基因沉默后对肌幼虫侵入肠粘膜、发育及雌虫生殖力的影响
        4.2.7 siRNA-653处理后对各虫期虫体形态大小的影响
5 讨论
6 结论
参考文献
综述
    参考文献
个人简历
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]应用RNA干扰技术对旋毛虫Ts87基因功能的初步研究[J]. 郝冉,杨雅平,杨静,王少华,诸欣平.  寄生虫与医学昆虫学报. 2008(01)



本文编号：3716310