Sin1-mTORC2在B细胞生长、分化发育、代谢及功能方面的作用及机制研究

发布时间：2023-01-03 10:11

　　mTOR属于保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它能够感知细胞周围生长因子、氨基酸及能量信号,继而参与维持细胞生长、增殖、代谢及存活等生命过程。mTOR由mTOR复合体1（mTORC1）及mTORC2构成,其中mTORC1通过影响S6K及4E-BP1促进蛋白质及核糖体的生成;mTORC2通过调节下游Akt、SGK1及PKC等AGC蛋白激酶家族磷酸化,对细胞存活、生长及代谢发挥重要作用。Sin1是mTORC2的重要组分之一,其在B细胞分化发育作用中的作用及机制尚不明确。本研究发现Sin1缺陷小鼠骨髓前体B细胞（pro/pre B）的比例显著增加,而成熟B细胞（mature B）的比例显著下降。在外周脾脏细胞分析中,Sin1缺陷小鼠的外周成熟B细胞比例明显下降。进一步分析过渡期B（transitional B）细胞结果表明,Sin1缺陷小鼠过渡期T1 B细胞比例显著上升,而过渡期T2/T3 B细胞比例下降,提示Sin1缺陷小鼠外周B细胞发育在T1 B时期出现发育阻滞。与此同时,Sin1缺陷小鼠B细胞大小从未成熟B（immature B）到T1、T2 B细胞时期均小于野生型（WT）组,且B细胞大小... 

【文章页数】：99 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略词表
第一章 绪论
    1.1 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)
        1.1.1 雷帕霉素的发现起源
        1.1.2 mTOR的组成及功能
        1.1.3 mTOR信号网络
        1.1.4 Sin1 概述
    1.2 B细胞发育及功能的研究进展回顾
        1.2.1 概述
        1.2.2 B细胞早期发育
        1.2.3 成熟B细胞的发育及其功能
    1.3 mTOR通路在B细胞的研究进展
        1.3.1 mTOR通路在B细胞发育及功能中的作用
        1.3.2 mTOR通路在生发中心B细胞形成及高亲和力抗体生成中的作用
    1.4 mTOR通路在B细胞代谢方面的研究进展
        1.4.1 mTOR与 B细胞糖代谢的关系
        1.4.2 mTOR与 B细胞氧化磷酸化代谢的关系
第二章 实验材料及方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 小鼠基因型鉴定引物
        2.1.2 主要实验试剂
    2.2 主要实验仪器及设备
    2.3 实验动物
        2.3.1 条件性敲除小鼠
        2.3.2 骨髓移植嵌合体小鼠的构建
    2.4 实验方法
        2.4.1 小鼠DNA样本制备
        2.4.2 PCR法鉴定小鼠基因型
        2.4.3 小鼠脾脏单细胞悬液制备
        2.4.4 小鼠淋巴结(腹股沟淋巴结)单细胞悬液制备
        2.4.5 小鼠外周血单细胞制备
        2.4.6 小鼠骨髓单细胞制备及骨髓移植嵌合小鼠构建
        2.4.7 流式细胞术检测细胞表面分子表达
        2.4.8 CFSE标记法检测细胞增殖情况
        2.4.9 细胞/细胞核内流式染色
        2.4.10 pro B细胞体外分化
        2.4.11 脾脏B细胞磁珠法富集
        2.4.12 细胞能量代谢检测
        2.4.13 应用T细胞依赖性抗原免疫小鼠
        2.4.14 ELISA法检测血清中抗原特异性抗体
        2.4.15 HA免疫及PR8 流感病毒攻毒实验
        2.4.16 ELISA法检测小鼠血清中HA特异性抗体
        2.4.17 HE(hematoxylin and eosin)染色
        2.4.18 B细胞信号通路研究的Western样本制备
        2.4.19 Westernblot技术检测BCR介导的B细胞下游信号通路改变情况
        2.4.20 统计学分析
第三章 实验结果
    3.1 Sin1-mTORC2对B细胞分化、发育的影响
        3.1.1 小鼠基因型鉴定结果
        3.1.2 Sin1 敲除小鼠B细胞发育阻滞
    3.2 Sin1-mTORC2对B细胞生长、代谢的影响
        3.2.1 Sin1 影响过渡期B细胞(transitional B)的大小
        3.2.2 Sin1 敲除导致B细胞凋亡增加
        3.2.3 Sin1 影响外周B细胞增殖功能及存活状态
        3.2.4 Sin1 敲除导致B细胞糖酵解及有氧呼吸代谢水平下降
    3.3 Sin1-mTORC2对B细胞功能的影响
        3.3.1 ROSA26-Cre-ERT2Sin1fl/-小鼠产生特异性抗体水平受损
        3.3.2 Cd19CreSin1fl/fl小鼠血清中特异性抗体水平检测
    3.4 Sin1-mTORC2 在甲型H1N1 流感模型中的作用初探
        3.4.1 Sin1 WT及 KO小鼠在HA血清凝集素蛋白初次免疫后特异性抗体生成情况
        3.4.2 Sin1 WT及 KO小鼠在HA抗原肽加强免疫后特异性抗体生成情况
        3.4.3 PR8 攻毒后小鼠体重变化及存活情况
        3.4.4 PR8 攻毒后小鼠肺部组织切片形态学观察
        3.4.5 Sin1 WT及 KO小鼠在PR8 攻毒后特异性抗体生成情况
    3.5 Sin1在BCR介导的信号通路中的作用
        3.5.1 Sin1 敲除小鼠B细胞内Akt Ser473 磷酸化水平降低
        3.5.2 Sin1 缺陷小鼠B细胞在BCR信号激活后介导的mTORC1 活化程度减弱
        3.5.3 Sin1-mTORC2 通过调控c-Myc表达水平影响B细胞生长
        3.5.4 Sin1/mTOR通过抑制GSK3 激酶的活性进而维持c-Myc的蛋白稳定性
第四章 全文总结及模式图
    4.1 全文总结
    4.2 工作示意图
    4.3 全文讨论
第五章 致谢
第六章 参考文献



本文编号：3727271