PD-1/PD-L1抗体的制备与鉴定研究
发布时间：2023-02-22 20:06
免疫检查点是在人体内免疫调控过程中的可以下调免疫效应细胞激活反应的关键因子,而PD-1正是T细胞上的重要免疫点之一。肿瘤细胞通过在其细胞膜表面高表达PD-L1与T细胞表面的PD-1结合,向吞噬细胞发出“Do not eat me”的信号,从而促进抗原特异性T细胞的凋亡,减少调节性T细胞的凋亡,最终实现免疫逃逸。阻断型抗体是通过阻断PD-1、PD-L1之间的信号传递,减少调节性T细胞的凋亡,从而增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。本研究以获取PD-1、PD-L1单克隆抗体为目的,通过病毒免疫技术、杂交瘤技术、全合成人源抗体库筛选技术等,获得了可以特异性识别PD-1蛋白的单克隆抗体4G9及PD-L1蛋白的单克隆抗体1A7。首先,通过病毒包装的方式,产生滴度为1×106TU/mL PD-1慢病毒颗粒。同时利用大肠杆菌表达系统制备浓度为0.54mg/mL,纯度>85%的PD-1ECD重组蛋白用于接下来的抗体检测实验。利用病毒颗粒感染小鼠,已达到抗原免疫的效果,其效价大于1:2.6×107。接着利用细胞融合技术获取7株可以产生特异性抗体的杂交瘤细胞,...
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 抗体治疗手段的优势及常用技术
1.2 免疫检查点抗体治疗手段
1.3 PD-1、PD-L1 分子
1.3.1 PD-1、PD-L1 的结构与分布
1.3.2 PD-1与PD-L1 的作用机制
1.3.3 PD-1、PD-L1 与肿瘤治疗
1.3.4 国内外研究进展
1.4 本课题内容概述
1.4.1 人源PD-1、PD-L1 胞外区重组蛋白的制备与鉴定
1.4.2 抗PD-1 鼠源单抗的筛选及制备
1.4.3 人源噬菌体抗体库的筛选及表达
第二章 人源PD-1、PD-L1 胞外区重组蛋白的制备与鉴定
2.1 实验材料
2.1.1 载体与菌株
2.1.2 实验仪器
2.1.3 实验试剂及耗材
2.1.4 溶液配制
2.2 方法
2.2.1 pET28a-PD-1ECD、pET28a-PD-L1ECD重组质粒构建
2.2.2 PD-1、PD-L1 重组蛋白的原核表达及鉴定
2.2.3 PD-1、PD-L1 重组蛋白的原核表达形式分析
2.2.4 PD-1、PD-L1 重组蛋白的纯化
2.2.5 PD-1、PD-L1 重组蛋白的抗原性鉴定
2.2.6 PD-1、PD-L1 重组蛋白的浓度测定
2.2.7 pCDH-CMV-MCS-EF1-EGFP-Puro-PD-1 重组质粒的构建及病毒包装
2.3 实验结果
2.3.1 pET28a-PD-1、pET28a-PD-L1 重组质粒的构建
2.3.2 重组蛋白的原核表达
2.3.3 重组蛋白的纯化
2.3.4 重组蛋白的抗原性鉴定
2.3.5 重组蛋白的浓度测定
2.3.6 pCDH-CMV-MCS-EF1-EGFP-Puro-PD-1 重组质粒的构建
2.3.7 病毒包装及滴度测定
2.4 小结与讨论
第三章 抗PD-1鼠源单抗的筛选及制备
3.1 实验材料
3.1.1 实验动物、细胞及菌株
3.1.2 实验仪器
3.1.3 实验试剂及耗材
3.1.4 溶液配制
3.2 方法
3.2.1 病毒免疫
3.2.2 间接ELISA检测免疫小鼠尾血血清效价
3.2.3 细胞融合
3.2.4 融合细胞培养
3.2.5 阳性杂交瘤细胞筛选
3.2.6 杂交瘤细胞的克隆化
3.2.7 阳性克隆细胞株cDNA的调取与保存
3.2.8 单抗的大量制备
3.2.9 腹水单抗纯化
3.2.10 抗体纯度分析
3.2.11 单克隆抗体的鉴定及评价
3.3 实验结果
3.3.1 间接ELISA法检测免疫后小鼠尾血血清效价
3.3.2 细胞融合及杂交瘤细胞培养
3.3.3 阳性克隆细胞株cDNA的调取
3.3.4 阳性克隆细胞株抗体可变区基因获取
3.3.5 抗体的大量制备与纯化
3.3.6 单克隆抗体的亚型鉴定
3.3.7 单克隆抗体亲和力的测定
3.3.8 单克隆抗体的特异性鉴定
3.3.9 稳定性评价
3.3.10 细胞ELISA鉴定单克隆抗体的结合能力
3.4 小结与讨论
第四章 人源噬菌体抗体库的筛选及表达
4.1 材料
4.1.1 菌株、噬菌体、质粒及抗体库
4.1.2 实验仪器
4.1.3 实验试剂及耗材
4.1.4 溶液配制
4.2 实验方法
4.2.1 抗PD-L1 人源性抗体筛选
4.2.2 全抗体表达及特异性评价
4.3 实验结果
4.3.1 以PD-L1 胞外区重组蛋白为抗原的噬菌体抗体库筛选
4.3.2 全抗表达载体的构建
4.3.3 阳性克隆细胞株抗体可变区基因获取
4.3.4 人源全抗体的表达与纯化
4.3.5 单克隆抗体的特异性鉴定
4.4 小结与讨论
总结
参考文献
个人简历及在学期间研究成果
致谢
本文编号：3748211
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 抗体治疗手段的优势及常用技术
1.2 免疫检查点抗体治疗手段
1.3 PD-1、PD-L1 分子
1.3.1 PD-1、PD-L1 的结构与分布
1.3.2 PD-1与PD-L1 的作用机制
1.3.3 PD-1、PD-L1 与肿瘤治疗
1.3.4 国内外研究进展
1.4 本课题内容概述
1.4.1 人源PD-1、PD-L1 胞外区重组蛋白的制备与鉴定
1.4.2 抗PD-1 鼠源单抗的筛选及制备
1.4.3 人源噬菌体抗体库的筛选及表达
第二章 人源PD-1、PD-L1 胞外区重组蛋白的制备与鉴定
2.1 实验材料
2.1.1 载体与菌株
2.1.2 实验仪器
2.1.3 实验试剂及耗材
2.1.4 溶液配制
2.2 方法
2.2.1 pET28a-PD-1ECD、pET28a-PD-L1ECD重组质粒构建
2.2.2 PD-1、PD-L1 重组蛋白的原核表达及鉴定
2.2.3 PD-1、PD-L1 重组蛋白的原核表达形式分析
2.2.4 PD-1、PD-L1 重组蛋白的纯化
2.2.5 PD-1、PD-L1 重组蛋白的抗原性鉴定
2.2.6 PD-1、PD-L1 重组蛋白的浓度测定
2.2.7 pCDH-CMV-MCS-EF1-EGFP-Puro-PD-1 重组质粒的构建及病毒包装
2.3 实验结果
2.3.1 pET28a-PD-1、pET28a-PD-L1 重组质粒的构建
2.3.2 重组蛋白的原核表达
2.3.3 重组蛋白的纯化
2.3.4 重组蛋白的抗原性鉴定
2.3.5 重组蛋白的浓度测定
2.3.6 pCDH-CMV-MCS-EF1-EGFP-Puro-PD-1 重组质粒的构建
2.3.7 病毒包装及滴度测定
2.4 小结与讨论
第三章 抗PD-1鼠源单抗的筛选及制备
3.1 实验材料
3.1.1 实验动物、细胞及菌株
3.1.2 实验仪器
3.1.3 实验试剂及耗材
3.1.4 溶液配制
3.2 方法
3.2.1 病毒免疫
3.2.2 间接ELISA检测免疫小鼠尾血血清效价
3.2.3 细胞融合
3.2.4 融合细胞培养
3.2.5 阳性杂交瘤细胞筛选
3.2.6 杂交瘤细胞的克隆化
3.2.7 阳性克隆细胞株cDNA的调取与保存
3.2.8 单抗的大量制备
3.2.9 腹水单抗纯化
3.2.10 抗体纯度分析
3.2.11 单克隆抗体的鉴定及评价
3.3 实验结果
3.3.1 间接ELISA法检测免疫后小鼠尾血血清效价
3.3.2 细胞融合及杂交瘤细胞培养
3.3.3 阳性克隆细胞株cDNA的调取
3.3.4 阳性克隆细胞株抗体可变区基因获取
3.3.5 抗体的大量制备与纯化
3.3.6 单克隆抗体的亚型鉴定
3.3.7 单克隆抗体亲和力的测定
3.3.8 单克隆抗体的特异性鉴定
3.3.9 稳定性评价
3.3.10 细胞ELISA鉴定单克隆抗体的结合能力
3.4 小结与讨论
第四章 人源噬菌体抗体库的筛选及表达
4.1 材料
4.1.1 菌株、噬菌体、质粒及抗体库
4.1.2 实验仪器
4.1.3 实验试剂及耗材
4.1.4 溶液配制
4.2 实验方法
4.2.1 抗PD-L1 人源性抗体筛选
4.2.2 全抗体表达及特异性评价
4.3 实验结果
4.3.1 以PD-L1 胞外区重组蛋白为抗原的噬菌体抗体库筛选
4.3.2 全抗表达载体的构建
4.3.3 阳性克隆细胞株抗体可变区基因获取
4.3.4 人源全抗体的表达与纯化
4.3.5 单克隆抗体的特异性鉴定
4.4 小结与讨论
总结
参考文献
个人简历及在学期间研究成果
致谢
本文编号：3748211
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/jichuyixue/3748211.html
