白脂素包涵体表达纯化及其功能评价

发布时间：2023-03-25 06:32

　　目的构建白脂素的原核表达质粒,表达及纯化重组白脂素蛋白,并初步探索其功能,为进一步研究白脂素作用机制及其生理病理作用提供依据。方法利用基因工程技术构建表达白脂素BL21菌株,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,梯度尿素复性,亲和层析纯化及去内毒素处理得到可用于细胞和动物实验的重组白脂素。采用血糖仪检测重组白脂素腹腔注射后C57小鼠血糖变化情况。Alamar Blue检测重组白脂素作用24 h对MIHA细胞活性的影响;重组白脂素刺激MIHA细胞24 h,用蒽酮法检测糖原含量。结果在37℃,A600 nm=0.8,IPTG终浓度为1 mmol/L诱导4 h目的蛋白表达效果较好。通过纯化和去内毒素处理,重组白脂素纯度大于95%,内毒素含量小于1 EU/mg,可以用于动物与细胞实验。腹腔注射重组白脂素60 min后C57小鼠血糖升高至峰值(重组白脂素组vs对照组P=0.021),120 min恢复到正常水平(重组白脂素组vs对照组P=0.03)。重组白脂素刺激MIHA细胞24 h,对细胞活性没有影响;检测糖原发现,不同浓度白脂素组糖原与对照组比较差异有统计学意义(P₁=0.013,...

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【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株、质粒与细胞、动物
        1.1.2 主要试剂与仪器
    1.2 方法
        1.2.1 白脂素表达载体的构建
        1.2.2转化感受态细胞
        1.2.3 表达条件优化
        1.2.4 包涵体变性与复性、纯化
        1.2.5 表达蛋白鉴定与去除内毒素
        1.2.6 重组白脂素对C57小鼠血糖的影响
        1.2.7 Alamar Blue法检测重组白脂素对MIHA细胞活性的影响
        1.2.8 纯化的白脂素对MIHA肝细胞糖原的作用
        1.2.9 统计分析
2 结果
    2.1 p ET-22b-asprosin质粒测序、His-Asprosin表达、包涵体复性及纯化条件
    2.2 重组蛋白的验证
    2.3 腹腔注射重组白脂素对小鼠血糖的影响
    2.4 白脂素对MIHA细胞活性的影响
    2.5 重组白脂素对MIHA细胞糖原代谢的作用
3 讨论



本文编号：3770739