EV71反向遗传学系统的构建与拯救病毒的获得及鉴定

发布时间：2023-04-21 01:26

　　目的建立高效的EV71病毒反向遗传学系统,通过转染和侵染两种不同的方式快速获得拯救病毒并鉴定其活性,同时对两种获得病毒的方式进行对比并探讨其特点与优势。方法1.先构建含有人RNA聚合酶I启动子(Ppol I)、ccdB自杀基因和鼠终止子(mTer)的接收质粒pHT-ccdB,并在ccdB两侧引入AarI酶切位点;为了回避EV71病毒基因组中自身的AarI酶切位点,分两段PCR扩增基因组,在引物中引入必需的AarI酶切位点,通过Golden Gate clone法连接到目的载体中获得病毒拯救质粒pHT-EV71,转染至RD细胞后,获得拯救的EV71病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot、以及电镜检测等方法鉴定拯救子代病毒。2.将已构建病毒拯救质粒pHT-EV71转化到DAP营养缺陷型的大肠杆菌Sw106感受态中,随机挑出12个较大的菌落进行培养,将获得的菌液直接侵染到RD细胞中,收集出现CPE现象的RD细胞上清,获得拯救病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot、以及电镜检测等方法鉴定拯救子代病毒。3.将转染和侵染两种方式获得的拯救病毒和野生毒株通过病...

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
符号说明
摘要
英文摘要
前言
第一部分 EV71反向遗传学系统的构建与质粒鉴定
    1.材料和方法
    2.实验结果
    3.讨论
第二部分 拯救病毒的获得及鉴定
    1.材料和方法
    2.实验结果
    3.讨论
第三部分 两种拯救病毒的获得方法的总结及初步探讨
    1.材料与方法
    2.实验结果
    3.讨论
全文小结
参考文献
文献综述 肠道病毒EV71的研究进展
    参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的学位论文



本文编号：3795552