TAP1通过乾向TAK1复合物负向调控宿主抗病毒天然免疫应答
发布时间：2024-12-21 22:30
当病毒感染宿主,病毒的特定组分会被宿主细胞的特定受体识别,信号再通过一些接头蛋白和激酶的传递,级联放大,最终诱导宿主表达出大量的抗病毒细胞因子和免疫调节因子,如干扰素,炎症因子和趋化因子。天然免疫应答对于宿主防御病毒入侵至关重要。另一方面,为了避免过度的免疫反应对机体造成伤害,浪费细胞资源,宿主的天然免疫应答需要被严谨地调控。关于宿主免疫系统的“刹车”机制,已经有不少研究报道了相关的现象和机制,同时,还有许多未知有待阐明。本研究鉴定了一个新的负向调控抗病毒天然免疫的宿主蛋白,抗原加工相关转运蛋白 1(transporter 1,associated with antigen processing),简称 TAP1。在不同的细胞系(A549,THP-l,HeLa)中用不同的病毒(IAV,VSV,SeV)测试,发现病毒感染能在转录水平显著诱导TAP1的表达。由于已有文章报道TAP1是干扰素诱导基因(ISG),我们利用siRAN介导的STAT1敲低和I型干扰素缺失的Vero细胞实验,发现病毒感染对TAP1的诱导表达不依赖于干扰素。进一步探究TAP1在病毒感染中是否具有调节功能。结果显示,在细胞...
【文章页数】：116 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
论文创新点
摘要
Abstract
第一章 天然免疫应答
1.1 天然免疫简介
1.2 干扰素
1.2.1 干扰素的分类和功能
1.2.2 干扰素基因的转录
1.2.3 干扰素受体
1.2.4 JAK-STAT信号通路
1.2.5 干扰素诱导基因(ISG)
1.3 促炎因子和炎症反应
1.3.1 炎症反应简介
1.3.2 病毒诱导的促炎因子表达
1.3.3 促炎因子的功能
1.3.3.1 IL-6
1.3.3.2 IL-8
1.3.3.3 IL-1β
1.3.3.4 TNF-α
1.4 天然免疫信号通路
1.4.1 TLRs信号通路
1.4.1.1 TLRs种类和结构
1.4.1.2 TLRs介导的天然免疫信号途径
1.4.2 RLRs信号通路
1.4.2.1 RLRs的种类和结构
1.4.2.2 RLRs介导的天然免疫信号途径
1.4.3 NLRs信号通路
1.4.3.1 NLRs的种类和结构
1.4.3.2 NLRs介导的天然免疫信号途径
1.4.4 胞质DNA受体信号通路
1.4.4.1 胞质DNA受体的种类和结构
1.4.4.2 胞质DNA受体介导的天然免疫信号途径
1.5 TAK1复合物在天然免疫信号通路中的作用
第二章 抗原加工相关转运蛋白1(TAP1)
2.1 TAP1基因的发现
2.2 TAP1的肽段转运功能
2.3 TAP复合物的结构
2.4 TAP1的表达调控
2.5 TAP1与病毒
第三章 病毒
3.1 流感病毒
3.2 仙台病毒
3.3 水泡性口炎病毒
3.4 肠道病毒71型
第四章 病毒感染诱导TAP1表达
4.1 实验材料
4.1.1 细胞及病毒
4.1.2 质粒
4.1.3 试剂
4.1.4 仪器和耗材
4.2 实验方法
4.2.1 细胞培养与转染
4.2.1.1 细胞复苏
4.2.1.2 细胞传代
4.2.1.3 细胞冻存
4.2.1.4 细胞转染
4.2.2 重组质粒构建
4.2.3 质粒转化和抽提
4.2.3.1 感受态细胞制备
4.2.3.2 YC法转化
4.2.3.3 质粒抽提
4.2.4 细胞总RNA提取和逆转录
4.2.4.1 细胞总RNA提取
4.2.4.2 RNA逆转录为cDNA
4.2.5 实时荧光定量PCR
4.2.6 蛋白质免疫印记
4.2.7 荧光素酶报告实验
4.2.8 IAV和SeV的扩增和效价测定
4.2.8.1 病毒扩增
4.2.8.2 效价测定
4.3 实验结果
4.3.1 病毒感染诱导TAP1 mRNA和蛋白质水平升高
4.3.2 病毒感染激活TAP1启动子活性
4.3.3 病毒对TAP1表达的诱导不依赖于干扰素
4.4 讨论
第五章 TAP1促进病毒复制
5.1 实验材料
5.1.1 细胞及病毒
5.1.2 质粒
5.1.3 试剂
5.1.4 仪器及耗材
5.2 实验方法
5.2.1 细胞培养与转染
5.2.1.1 细胞培养
5.2.1.2 细胞转染
5.2.2 流感病毒复制测定
5.2.3 VSV空斑实验
5.2.4 流式细胞术检测VSV-eGFP复制效率
5.2.5 TAP1稳定敲减A549细胞系的构建
5.2.5.1 pLKO.1-shTAP1质粒构建
5.2.5.2 慢病毒的包装、感染和目标细胞系的筛选
5.2.6 细胞计数
5.3 实验结果
5.3.1 过表达TAP1能促进病毒复制
5.3.2 敲低TAP1表达能削弱病毒复制
5.3.3 TAP1对病毒复制的影响与干扰素应答相关
5.4 讨论
第六章 TAP1负调控病毒诱导的干扰素应答
6.1 实验材料
6.1.1 细胞及病毒
6.1.2 质粒
6.1.3 试剂
6.2 实验方法
6.2.1 荧光素酶报告实验
6.2.2 细胞总RNA提取和逆转录
6.2.3 实时荧光定量PCR
6.2.4 半定量PCR
6.2.5 蛋白质免疫印记
6.2.6 TAP1稳定敲减THP-1细胞系构建
6.3 实验结果
6.3.1 过表达TAP1能负调控病毒诱导的干扰素应答
6.3.1.1 过表达TAP1对干扰素启动子活性的影响
6.3.1.2 过表达TAP1对内源性干扰素表达的影响
6.3.1.3 过表达TAP1对干扰素诱导基因的表达的影响
6.3.2 敲低TAP1能正调控病毒诱导的干扰素应答
6.3.2.1 敲低TAP1对干扰素启动子活性的影响
6.3.2.2 敲低TAP1对内源性干扰素表达的影响
6.3.2.3 敲低TAP1对干扰素诱导基因的表达的影响
6.4 讨论
第七章 TAP1负调控病毒诱导的促炎因子表达
7.1 实验材料
7.1.1 细胞与病毒
7.1.2 质粒
7.2 实验方法
7.2.1 细胞培养与转染
7.2.2 荧光素酶报告实验
7.2.3 细胞总RNA提取和逆转录
7.2.4 实时荧光定量PCR
7.2.5 蛋白质免疫印迹
7.3 实验结果
7.3.1 过表达TAP1对病毒诱导的IL-6,IL-8启动子的影响
7.3.2 过表达TAP1对病毒诱导的内源性促炎因子表达的影响
7.3.3 敲低TAP1对病毒诱导的内源性促炎因子表达的影响
7.4 讨论
第八章 TAP1通过靶向TAK1复合物调控免疫应答
8.1 实验材料
8.1.1 细胞与病毒
8.1.2 质粒
8.1.3 试剂
8.1.4 仪器及耗材
8.2 实验方法
8.2.1 荧光素酶报告实验
8.2.2 蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)
8.2.3 亚细胞组分分离
8.2.4 免疫荧光实验
8.3 实验结果
8.3.1 TAP1通过TAK1复合物调控病毒诱导的信号通路
8.3.2 外源表达的TAP1与TAK1复合物相互作用
8.3.3 内源性的TAP1与TAK1相互作用
8.3.4 病毒感染对TAP1亚细胞定位的影响
8.4 讨论
第九章 TAP1抑制病毒诱导的TAK1磷酸化及其下游信号通路
9.1 实验材料
9.1.1 细胞及病毒
9.1.2 质粒
9.1.3 试剂
9.2 实验方法
9.2.1 蛋白质免疫印迹
9.2.2 核质分离实验
9.2.3 免疫荧光实验
9.3 实验结果
9.3.1 TAP1抑制病毒诱导的TAK1磷酸化
9.3.2 TAP1抑制病毒诱导的IKK,IκBα和p38 MAPK的磷酸化
9.3.3 TAP1抑制病毒诱导的NF-κB入核
9.4 讨论
第十章 研究总结和展望
参考文献
博士在读期间已发表和待发表的文章
附录 常用试剂配制
致谢
本文编号：4019004
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【学位级别】：博士
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论文创新点
摘要
Abstract
第一章 天然免疫应答
1.1 天然免疫简介
1.2 干扰素
1.2.1 干扰素的分类和功能
1.2.2 干扰素基因的转录
1.2.3 干扰素受体
1.2.4 JAK-STAT信号通路
1.2.5 干扰素诱导基因(ISG)
1.3 促炎因子和炎症反应
1.3.1 炎症反应简介
1.3.2 病毒诱导的促炎因子表达
1.3.3 促炎因子的功能
1.3.3.1 IL-6
1.3.3.2 IL-8
1.3.3.3 IL-1β
1.3.3.4 TNF-α
1.4 天然免疫信号通路
1.4.1 TLRs信号通路
1.4.1.1 TLRs种类和结构
1.4.1.2 TLRs介导的天然免疫信号途径
1.4.2 RLRs信号通路
1.4.2.1 RLRs的种类和结构
1.4.2.2 RLRs介导的天然免疫信号途径
1.4.3 NLRs信号通路
1.4.3.1 NLRs的种类和结构
1.4.3.2 NLRs介导的天然免疫信号途径
1.4.4 胞质DNA受体信号通路
1.4.4.1 胞质DNA受体的种类和结构
1.4.4.2 胞质DNA受体介导的天然免疫信号途径
1.5 TAK1复合物在天然免疫信号通路中的作用
第二章 抗原加工相关转运蛋白1(TAP1)
2.1 TAP1基因的发现
2.2 TAP1的肽段转运功能
2.3 TAP复合物的结构
2.4 TAP1的表达调控
2.5 TAP1与病毒
第三章 病毒
3.1 流感病毒
3.2 仙台病毒
3.3 水泡性口炎病毒
3.4 肠道病毒71型
第四章 病毒感染诱导TAP1表达
4.1 实验材料
4.1.1 细胞及病毒
4.1.2 质粒
4.1.3 试剂
4.1.4 仪器和耗材
4.2 实验方法
4.2.1 细胞培养与转染
4.2.1.1 细胞复苏
4.2.1.2 细胞传代
4.2.1.3 细胞冻存
4.2.1.4 细胞转染
4.2.2 重组质粒构建
4.2.3 质粒转化和抽提
4.2.3.1 感受态细胞制备
4.2.3.2 YC法转化
4.2.3.3 质粒抽提
4.2.4 细胞总RNA提取和逆转录
4.2.4.1 细胞总RNA提取
4.2.4.2 RNA逆转录为cDNA
4.2.5 实时荧光定量PCR
4.2.6 蛋白质免疫印记
4.2.7 荧光素酶报告实验
4.2.8 IAV和SeV的扩增和效价测定
4.2.8.1 病毒扩增
4.2.8.2 效价测定
4.3 实验结果
4.3.1 病毒感染诱导TAP1 mRNA和蛋白质水平升高
4.3.2 病毒感染激活TAP1启动子活性
4.3.3 病毒对TAP1表达的诱导不依赖于干扰素
4.4 讨论
第五章 TAP1促进病毒复制
5.1 实验材料
5.1.1 细胞及病毒
5.1.2 质粒
5.1.3 试剂
5.1.4 仪器及耗材
5.2 实验方法
5.2.1 细胞培养与转染
5.2.1.1 细胞培养
5.2.1.2 细胞转染
5.2.2 流感病毒复制测定
5.2.3 VSV空斑实验
5.2.4 流式细胞术检测VSV-eGFP复制效率
5.2.5 TAP1稳定敲减A549细胞系的构建
5.2.5.1 pLKO.1-shTAP1质粒构建
5.2.5.2 慢病毒的包装、感染和目标细胞系的筛选
5.2.6 细胞计数
5.3 实验结果
5.3.1 过表达TAP1能促进病毒复制
5.3.2 敲低TAP1表达能削弱病毒复制
5.3.3 TAP1对病毒复制的影响与干扰素应答相关
5.4 讨论
第六章 TAP1负调控病毒诱导的干扰素应答
6.1 实验材料
6.1.1 细胞及病毒
6.1.2 质粒
6.1.3 试剂
6.2 实验方法
6.2.1 荧光素酶报告实验
6.2.2 细胞总RNA提取和逆转录
6.2.3 实时荧光定量PCR
6.2.4 半定量PCR
6.2.5 蛋白质免疫印记
6.2.6 TAP1稳定敲减THP-1细胞系构建
6.3 实验结果
6.3.1 过表达TAP1能负调控病毒诱导的干扰素应答
6.3.1.1 过表达TAP1对干扰素启动子活性的影响
6.3.1.2 过表达TAP1对内源性干扰素表达的影响
6.3.1.3 过表达TAP1对干扰素诱导基因的表达的影响
6.3.2 敲低TAP1能正调控病毒诱导的干扰素应答
6.3.2.1 敲低TAP1对干扰素启动子活性的影响
6.3.2.2 敲低TAP1对内源性干扰素表达的影响
6.3.2.3 敲低TAP1对干扰素诱导基因的表达的影响
6.4 讨论
第七章 TAP1负调控病毒诱导的促炎因子表达
7.1 实验材料
7.1.1 细胞与病毒
7.1.2 质粒
7.2 实验方法
7.2.1 细胞培养与转染
7.2.2 荧光素酶报告实验
7.2.3 细胞总RNA提取和逆转录
7.2.4 实时荧光定量PCR
7.2.5 蛋白质免疫印迹
7.3 实验结果
7.3.1 过表达TAP1对病毒诱导的IL-6,IL-8启动子的影响
7.3.2 过表达TAP1对病毒诱导的内源性促炎因子表达的影响
7.3.3 敲低TAP1对病毒诱导的内源性促炎因子表达的影响
7.4 讨论
第八章 TAP1通过靶向TAK1复合物调控免疫应答
8.1 实验材料
8.1.1 细胞与病毒
8.1.2 质粒
8.1.3 试剂
8.1.4 仪器及耗材
8.2 实验方法
8.2.1 荧光素酶报告实验
8.2.2 蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)
8.2.3 亚细胞组分分离
8.2.4 免疫荧光实验
8.3 实验结果
8.3.1 TAP1通过TAK1复合物调控病毒诱导的信号通路
8.3.2 外源表达的TAP1与TAK1复合物相互作用
8.3.3 内源性的TAP1与TAK1相互作用
8.3.4 病毒感染对TAP1亚细胞定位的影响
8.4 讨论
第九章 TAP1抑制病毒诱导的TAK1磷酸化及其下游信号通路
9.1 实验材料
9.1.1 细胞及病毒
9.1.2 质粒
9.1.3 试剂
9.2 实验方法
9.2.1 蛋白质免疫印迹
9.2.2 核质分离实验
9.2.3 免疫荧光实验
9.3 实验结果
9.3.1 TAP1抑制病毒诱导的TAK1磷酸化
9.3.2 TAP1抑制病毒诱导的IKK,IκBα和p38 MAPK的磷酸化
9.3.3 TAP1抑制病毒诱导的NF-κB入核
9.4 讨论
第十章 研究总结和展望
参考文献
博士在读期间已发表和待发表的文章
附录 常用试剂配制
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