锌转运体Zip7对线粒体自噬的调控作用及分子机制研究

发布时间：2025-02-06 16:46

　　目的1.观察再灌注时Zip7达上调是否通过抑制心肌细胞线粒体自噬来增加线粒体ROS的产生。2.探讨Zip7调控线粒体自噬的分子机制。方法用大鼠心脏缺血/再灌注损伤模型和H9c2细胞缺氧/复氧模型,检测再灌注及复氧期Zip7的表达变化情况;构建Zip7敲除的杂合子小鼠,检测其胚胎组织中线粒体自噬标志蛋白TOM20的表达情况;利用H9c2细胞构建Zip7敲除及Zip7过表达的稳定细胞株;用Western blotting法检测TOM20、PINK1及Parkin的蛋白表达变化情况;利用Zip7 siRNA进行瞬时转染,检测TOM20蛋白表达;用Mitosox red荧光探针检测线粒体内超氧化物含量;用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位（△Ψm）的变化情况;用细胞免疫荧光技术观察PINK1及Parkin在细胞内的定位;用Zinpyr-1锌离子绿色荧光探针检测细胞内锌离子含量;利用RNA-Seq测序技术检测并筛选Zip7基因敲除时自噬及线粒体自噬差异基因。结果1.QPCR及Western blotting结果显示,与对照组相比,大鼠心脏缺血/再灌注组Zip7的mRNA及蛋白表达均升高。与对照组相比...

【文章页数】：117 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略语
前言
    研究现状、成果
    目的和方法
一、探讨再灌注时Zip7表达变化及其与线粒体自噬的关系
    1.1 对象和方法
        1.1.1 研究对象
        1.1.2 实验仪器
        1.1.3 常用试剂
        1.1.4 关键试剂及试剂盒
        1.1.5 抗体
        1.1.6 H9c2 细胞的复苏
        1.1.7 H9c2 细胞的冻存
        1.1.8 H9c2 细胞的传代
        1.1.9 细胞计数
        1.1.10 建立H9c2 细胞缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)模型
        1.1.11 建立大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤模型
        1.1.12 利用CRISPR Cas9 技术建立Zip7 敲除的H9c2 细胞系
        1.1.13 构建Zip7 过表达稳定细胞株
        1.1.14 H9c2 细胞siRNA转染
        1.1.15 GFP-LC3 质粒转染
        1.1.16 构建Zip7 基因敲除小鼠
        1.1.17 RNA提取
        1.1.18 RNA逆转录(RT-PCR)
        1.1.19 Real-time PCR(QPCR)反应
        1.1.20 蛋白免疫印迹(Western blotting)
        1.1.21 Mitosox red检测线粒体内超氧化物
        1.1.22 JC-1 检测细胞内线粒体膜电位
        1.1.23 细胞免疫荧光技术
        1.1.24 Mitotracker red及 Zinpyr-1 共染法检测线粒体内锌离子含量变化
        1.1.25 线粒体的提取
        1.1.26 统计学分析
    1.2 结果
        1.2.1 H9c2 细胞缺氧/复氧时Zip7 表达上调
        1.2.2 大鼠离体心脏缺血/再灌注时Zip7 表达上调
        1.2.3 锌离子和TPEN不影响Zip7 的表达
        1.2.4 BAPTA-AM可抑制H9c2 细胞复氧期Zip7 表达上调
        1.2.5 EGTA可抑制H9c2 细胞复氧期Zip7 表达上调
        1.2.6 CaCl2 可上调H9c2 细胞Zip7 蛋白表达
        1.2.7 Zip7 siRNA使线粒体自噬增强
        1.2.8 Zip7 基因敲除诱导自噬及线粒体自噬
        1.2.9 Zip7 基因敲除小鼠自噬及线粒体自噬增强
        1.2.10 Zip7 的过表达可抑制自噬及线粒体自噬
        1.2.11 缺氧/复氧时Zip7 基因敲除促进线粒体自噬
        1.2.12 Zip7 基因敲除减轻再灌注时线粒体ROS的产生
        1.2.13 H9c2 细胞过表达Zip7 后线粒体内ROS升高
    1.3 讨论
    1.4 小结
二、探讨Zip7 抑制线粒体自噬的分子机制
    2.1 结果
        2.1.1 Zip7 定位于H9c2 细胞线粒体
        2.1.2 Zip7 敲除后H9c2 细胞线粒体内锌离子增多
        2.1.3 Zip7 基因敲除使H9c2 细胞线粒体膜电位降低(去极化)
        2.1.4 Zip7 过表达后H9c2 细胞线粒体膜电位升高
        2.1.5 H9c2 细胞Zip7 基因敲除使PINK1 在线粒体的聚集增多
        2.1.6 Zip7 基因敲除使Parkin在线粒体的聚集增多
        2.1.7 敲降Parkin可抑制Zip7 诱导的线粒体自噬
    2.2 讨论
    2.3 小结
全文结论
论文创新点
参考文献
发表论文和参加科研情况说明
附录
综述 锌转运体Zip7 与线粒体自噬
    综述参考文献
致谢
个人简历



本文编号：4030599