热休克蛋白gp96作为新型佐剂增强BCG疫苗T细胞应答

发布时间：2017-06-05 11:01

  本文关键词：热休克蛋白gp96作为新型佐剂增强BCG疫苗T细胞应答，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：结核病是继艾滋病之后,全世界由单一传染性病原体引发的最大疾病。卡介苗(简称BCG)是用于预防结核病的疫苗,虽然卡介苗在很多地方仍然使用,但是不可忽略的是其疫苗效率逐年降低。不同地区,不同年龄的人群接种后,卡介苗的效果都会有所不同。目前BCG的免疫效率在0-80%之间,免疫功效有待进一步提高。本实验室前期研究发现,热休克蛋白gp96能通过抗原呈递激活特异性T细胞并且具有天然佐剂功能。通过查阅大量文献,我们发现有关于乳铁蛋白作为佐剂对BCG疫苗保护效率的研究。但由于乳铁蛋白表达量低,纯化操作复杂,因此没有大规模的生产。受此启发,本研究以gp96作为BCG的新型佐剂联合免疫C57BL/6小鼠,考察gp96是否活化BCG特异性T细胞,为增强BCG的免疫效率提供新的思路。本文首先利用实验室已有的gp96昆虫表达载体表达gp96蛋白,然后对表达的目的蛋白进行纯化并通过SDS-PAGE和Western Blot鉴定,结果显示纯度达到95%。利用酶联免疫斑点实验、流式细胞内因子染色技术检测gp96是否增强BCG特异性细胞应答,结果显示gp96可以使BCG特异性的细胞免疫水平提高约50%。再通过酶联免疫吸附试验检测血清中的炎症因子IFN-γ、IL-2、TnF-α、IL12、IL-10的分泌,分析得出gp96能有效提高血清中促炎症因子的分泌,降低抗炎症因子的分泌。进一步研究gp96作为佐剂提高小鼠对BCG感染的免疫保护作用。分别在第一、二、四周免疫的小鼠,第五周BCG肺内给药48h后处死,取肺部组织研磨涂板,结果显示BCG联合gp96免疫比BCG单独免疫组小鼠肺部活菌数降低36%。HE染色也可看出BCG+gp96免疫组肺部形态更完好。说明热休克蛋白gp96可以有效降低BCG引起的肺部感染。最后通过对1,2和4周免疫的小鼠,第5周尾静脉注射BCG攻毒。在尾静脉攻毒后18天的观察期内,BCG组免疫的小鼠比gp96+BCG组免疫的小鼠体重降幅明显。综上所述,gp96作为新型佐剂能有效增强BCG疫苗的T细胞应答,这为提高BCG疫苗的免疫效率提供了新的思路,同时也为临床开发gp96佐剂疫苗提供依据。
【关键词】：BCG gp96 佐剂 结核
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文缩写词表7-10
• 第一章 前言10-22
• 1 热休克蛋白gp96的概述10-18
• 1.1 热休克蛋白概述10-11
• 1.2 热休克蛋白90(HSP90)家族11
• 1.3 热休克蛋白gp9611-18
• 1.3.1 gp96结构特点12-14
• 1.3.2 gp96功能特点14-18
• 2 结核病的概述18-22
• 2.1 研究结核病的意义18-19
• 2.2 结核的发病机制19-20
• 2.3 结核分枝杆菌20-21
• 2.4 卡介苗与结核疫苗的现状21-22
• 第二章 材料与方法22-32
• 1 实验材料22-24
• 1.1 质粒、细胞系和实验动物22
• 1.2 主要试剂及试剂盒22
• 1.3 实验仪器22-23
• 1.4 主要溶液及试剂配置23-24
• 2 实验方法24-32
• 2.1 PCR扩增24-25
• 2.2 质粒的提取25-26
• 2.3 重组质粒的转化26
• 2.4 琼脂糖凝胶电泳26-27
• 2.5 SDS-PAGE27
• 2.6 Western blot27-28
• 2.7 卡介苗(BCG)菌株的培养28
• 2.8 小鼠肺部给药和尾静脉攻毒28-29
• 2.9 脾脏淋巴细胞分离29
• 2.10 酶联免疫斑点试验29-30
• 2.11 细胞内因子染色30
• 2.12 酶联免疫吸附试验30
• 2.13 小鼠肺部菌落形成单位的测定30-31
• 2.14 苏木精-伊红染色(H&E染色)31-32
• 第三章 结果32-44
• 1 gp96重组昆虫表达载体的构建32-34
• 1.1 引物设计32-33
• 1.2 目的基因的扩增和重组33-34
• 2 目的蛋白的纯化与鉴定34-38
• 2.1 目的蛋白的纯化34-37
• 2.2 目的蛋白的鉴定37-38
• 3 gp96作为佐剂影响BCG特异性T细胞应答38-44
• 3.1 gp96作为佐剂增强BCG特异性细胞应答38-40
• 3.2 gp96作为佐剂促进小鼠促炎症因子的分泌,抑制抗炎症因子分泌40-41
• 3.3 gp96作为佐剂可以降低结核杆菌引起的小鼠肺部损伤41-42
• 3.4 gp96作为佐剂可以有效降低小鼠死亡率42-44
• 第四章 讨论44-46
• 主要参考文献46-52
• 致谢52-53
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文53

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