利用酪蛋白激酶Ⅰδ磷酸化修饰半乳糖凝集素-3

发布时间：2017-06-06 01:13

  本文关键词：利用酪蛋白激酶Ⅰδ磷酸化修饰半乳糖凝集素-3，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：半乳糖凝集素-3(Galectin-3)是半乳糖凝集素家族中唯一的嵌合型蛋白,其分子量约为31 kDa。作为一种肿瘤相关蛋白,Galectin-3在肿瘤细胞中高表达,与细胞生长、粘附、凋亡以及血管生成、炎症反应、免疫调节、肿瘤发生和转移等密切相关。酪蛋白激酶I(Casein Kinase I)是丝氨酸/苏氨酸选择性蛋白激酶,共有7个亚型(α,β,γ1,γ2,γ3,ε,δ),分子量为22到55 kDa,等电点大于9。多分布于真核细胞中的细胞核、细胞质和纺锤体中。Casein Kinase I有重要的生理功能,它参与很多生理生化过程,如生命节律、细胞信号转导、DNA修复和DNA翻译等。文献报道,Galectin-3能被Casein Kinase Iδ磷酸化,细胞内30%Galectin-3以磷酸化的形式存在,但磷酸化的Galectin-3的功能却不清楚。为此,本论文作为研究磷酸化Galectin-3功能的前期工作,探索了Casein Kinase Iδ磷酸化Galectin-3的生化反应条件,检测方法以及磷酸化位点,为大量制备磷酸化的Galectin-3和深入研究其功能奠定基础。具体研究内容和成果如下:首先,构建Casein Kinase Iδ表达载体,并表达纯化Casein Kinase Iδ蛋白。主要过程包括:从人结肠癌细胞HCT-116中提取细胞总RNA,经过反转录获得cDNA。根据NCBI Gene Bank收录的Casein Kinase Iδ序列设计引物,以cDNA为模板,扩增出Casein Kinase Iδ的目的基因序列。经过测序结果比对,确认目的基因序列正确。对目的基因与载体进行酶切、连接、转化,构建了pET 28a Casein Kinase Iδ表达质粒。用Ni-NTA亲和柱提取和纯化目的蛋白。经过SDS-PAGE检测,获得的目的蛋白为Casein Kinase Iδ蛋白。然后,建立两种检测Casein Kinase Iδ催化Galectin-3磷酸化的方法。通过HPLC对Galectin-3磷酸化反应体系中ATP消耗情况进行检测,我们发现Casein Kinase Iδ能够将Galectin-3磷酸化,反应消耗了ATP;通过Native-PAGE与Western blot对Galectin-3磷酸化反应产物进行检测,我们发现在磷酸化反应后有被Galectin-3特异性抗体所识别的磷酸化条带产生。基于以上实验结果,我们认为这两种检测方法都可以用来检测由Casein Kinase Iδ催化的Galectin-3磷酸化反应。此外,我们对磷酸化反应条件进行了优化。当固定底物Galectin-3的量为25μg,ATP为200μM时,优化得到了反应条件,即Casein Kinase Iδ的量为0.375μg,反应温度为20 oC,反应时间为10 min。最后,对Galectin-3的磷酸化位点进行探究。考虑到Casein Kinase Iδ为丝氨酸选择性蛋白激酶,我们设计引物将Galectin-3的丝氨酸(6位、12位、96位和188位)定点突变为丙氨酸。经电泳验证、测序比对,我们得到了仅有目标位点发生突变的4种突变体质粒。之后,我们诱导突变体蛋白表达,并用Lactose-Sepharose CL 6B凝胶柱对突变体蛋白进行分离纯化。通过对比突变型与野生型Galectin-3的磷酸化反应情况,我们发现当6位的丝氨酸发生突变时,磷酸化条带消失,磷酸化反应不能发生。据此我们得出结论:由Casein Kinase Iδ催化的Galectin-3磷酸化发生在Galectin-3的N端6位丝氨酸。
【关键词】：半乳糖凝集素-3 酪蛋白激酶Iδ 磷酸化修饰
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3411;Q51
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 中英文对照及英文缩写词表7-10
• 第一章 前言10-18
• 1.1 Galectin-3 的概述10-14
• 1.2 Casein Kinase I的概述14-16
• 1.3 Galectin-3 磷酸化修饰的研究进展16-17
• 1.4 选题依据及研究意义17-18
• 第二章 Casein Kinase Iδ 表达载体构建和蛋白提取18-30
• 2.1 实验材料、试剂与仪器18-21
• 2.1.1 实验材料与试剂18-19
• 2.1.2 实验试剂配制19-21
• 2.1.3 实验仪器21
• 2.2 实验方法21-25
• 2.2.1 引物设计21
• 2.2.2 RT-PCR扩增目的基因21-22
• 2.2.3 目的基因与质粒的双酶切反应22-23
• 2.2.4 目的基因与质粒的连接23
• 2.2.5 制备感受态细菌23
• 2.2.6 目的质粒的转化23-24
• 2.2.7 Colony PCR验证24
• 2.2.8 提取质粒并测序24
• 2.2.9 诱导菌体表达目的蛋白24
• 2.2.10 目的蛋白提取与纯化24-25
• 2.2.11 变性聚丙烯胺凝胶电泳25
• 2.2.12 蛋白透析与保存25
• 2.3 实验结果与讨论25-30
• 2.3.1 目的片段的获得25
• 2.3.2 构建表达质粒25-26
• 2.3.3 测序结果26-28
• 2.3.4 目的蛋白的诱导表达28-30
• 第三章 Casein Kinase Iδ 催化Galectin-3 磷酸化的反应体系和检测方法的研究30-38
• 3.1 实验材料、试剂与仪器30-31
• 3.1.1 实验材料与试剂30
• 3.1.2 实验试剂配制30-31
• 3.1.3 实验仪器31
• 3.2 实验方法31-33
• 3.2.1 Galectin-3 的磷酸化反应31-32
• 3.2.2 HPLC法检测Galectin-3 磷酸化反应中ATP的消耗情况32
• 3.2.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳32
• 3.2.4 考马斯亮蓝染色与脱色32
• 3.2.5 蛋白免疫印迹32
• 3.2.6 优化Galectin-3 磷酸化反应条件32-33
• 3.3 实验结果与讨论33-38
• 3.3.1 HPLC检测Galectin-3 磷酸化反应中ATP消耗情况33-35
• 3.3.2 电泳和免疫印迹法检测Galectin-3 磷酸化反应产物35-36
• 3.3.3 Galectin-3 磷酸化反应条件优化36-38
• 第四章 Galectin-3 磷酸化位点的确定38-52
• 4.1 实验材料、试剂与仪器38-39
• 4.1.1 实验材料与试剂38
• 4.1.2 实验仪器38-39
• 4.2 实验方法39-41
• 4.2.1 定点突变实验39-40
• 4.2.2 突变体蛋白的提取40-41
• 4.3 实验结果与讨论41-52
• 4.3.1 定点突变实验41-50
• 4.3.2 Galectin-3 突变体蛋白的提取50
• 4.3.3 Galectin-3 磷酸化位点的确定50-52
• 总结52-54
• 参考文献54-58
• 致谢58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 缪宇,王承龙,殷惠军,史大卓,陈可冀;高效液相色谱测定大鼠心肌组织腺苷酸含量[J];北京大学学报(医学版);2005年02期

2 刘炜;毕玉平;李臻;;Ⅰ型酪蛋白激酶的研究进展[J];西北植物学报;2008年02期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 高晓鸽;人参果胶与半乳凝素-3相互作用的构效关系研究[D];东北师范大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 薛慧婷;果胶与半乳凝素-3的相互作用对T细胞聚集及凋亡的影响[D];东北师范大学;2012年

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本文编号：425055