日本血吸虫TOR基因克隆表达及生物学功能研究

发布时间：2017-06-06 12:15

  本文关键词：日本血吸虫TOR基因克隆表达及生物学功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：血吸虫病仍然是一个全球性公共卫生问题,数以亿计的人受其威胁。环境治理和药物干预是当前防控的主要措施。研发高效、安全的疫苗是血吸虫病持续控制的研究方向之一。宿主补体是宿主免疫杀伤寄生虫的重要效应因子,血吸虫可以通过一些自身蛋白调节宿主补体级联反应而逃避宿主的免疫攻击。血吸虫体被表膜中具抑制补体功能的蛋白有可能成为疫苗候选分子。四跨膜孤儿受体(TOR)是一种多跨膜受体蛋白,具有补体C2结合位点,可抑制C3转化酶的形成而调节补体级联反应。曼氏血吸虫TOR(Sm TOR)的研究表明,该分子能诱导较高的保护效果。本文根据实验室前期日本血吸虫体被表膜蛋白质组研究结果,开展了日本血吸虫TOR(Sj TOR)蛋白特性和生物学功能研究。根据Sj TOR参考序列,设计引物应用PCR克隆得到Sj TOR基因片段,长度为1245 bps,编码414个氨基酸,比对分析显示与Sm TOR、埃及血吸虫TOR(Sh TOR)、锥虫TOR相似性分别为77.0%、72.0%、和75.0%。序列分析显示,Sj TOR不含信号肽,具有5个N糖基化位点;跨膜结构预测表明,Sj TOR包含四个跨膜结构域。实时定量PCR结果显示,Sj TOR在虫体发育的各个时期均有转录,在尾蚴时期转录水平最高,在雌虫中的转录明显高于雄虫。免疫组化实验结果表明Sj TOR主要分布于虫体的表膜,在实质组织也有分布。根据Sj TOR第一个膜外区(Sj TOR-ed1,AA 47-168)序列设计合成引物,构建含Sj TOR第一个膜外区(Sj TOR-ed1)基因的重组表达质粒p ET-28a-Sj TOR-ed1,在BL21(DE3)大肠杆菌中诱导表达,并用组蛋白亲和层析纯化获得重组蛋白r Sj TOR-ed1,分子量约为14 k Da。Western blot结果表明重组蛋白r Sj TOR-ed1具有良好的免疫原性。用重组蛋白r Sj TOR-ed1免疫小鼠,在两次独立的动物实验中分别获得了24.51%和26.51%的减虫率及39.62%和32.92%的肝脏减卵率。ELISA结果表明重组蛋白r Sj TOR-ed1能够诱导小鼠产生较高水平的特异性Ig G抗体,抗体亚型分析结果显示,免疫重组蛋白r Sj TOR-ed1能够诱导产生Ig G1和Ig G2a抗体,且Ig G1与Ig G2a的比值在第4周达到最高后逐渐下降。溶血试验结果表明,重组蛋白r Sj TOR-ed1能抑制补体溶血且在浓度为0.2~1.0μM之间时其补体抑制作用呈剂量依赖性,蛋白浓度为10μM时的溶血抑制率可达60.26%。补体C2结合试验结果表明,重组蛋白r Sj TOR-ed1可与补体C2结合。根据Sj TOR基因序列设计并合成4对特异的si RNAs,应用浸泡法对体外培养的童虫Sj TOR进行干扰,实时定量PCR技术检测结果显示,与空白对照组相比,4对si RNAs对TOR基因的转录分别产生了45.12%、38.05%、25.46%、44.25%的干扰效果。综上,本文成功克隆了Sj TOR基因,查明其在日本血吸虫尾蚴中转录水平较高,主要表达分布在血吸虫体被,并在大肠杆菌中表达纯化到含其ed1的重组蛋白r Sj TOR-ed1,实验验证该重组蛋白r Sj TOR-ed1能通过与补体C2结合的方式抑制补体活性,用重组蛋白r Sj TOR-ed1免疫小鼠可诱导产生显著的保护效果。研究结果表明Sj TOR是一种有潜力的抗血吸虫疫苗候选分子。
【关键词】：日本血吸虫 四跨膜孤儿受体 C2结合蛋白 疫苗
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R383.24
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 文献综述13-23
• 1.1 引言13-14
• 1.2 血吸虫免疫逃避14-17
• 1.2.1 血吸虫免疫逃避方式14-17
• 1.2.2 小结与展望17
• 1.3 血吸虫与补体17-20
• 1.3.1 补体激活途径与补体调节18-20
• 1.4 血吸虫病的疫苗研究20-23
• 第二章 日本血吸虫基因SjTOR的克隆及其表达特性分析23-34
• 2.1 引言23
• 2.2 实验材料23-25
• 2.2.1 生物材料23
• 2.2.2 主要仪器23-24
• 2.2.3 主要酶和试剂24
• 2.2.4 试剂配制24-25
• 2.3 实验方法25-28
• 2.3.1 SjTOR基因的克隆及生物信息学分析25-26
• 2.3.2 日本血吸虫cDNA制备26-27
• 2.3.3 荧光实时定量PCR分析SjTOR在不同期别及性别虫体中转录水平27-28
• 2.3.4 SjTOR在虫体中的组织定位28
• 2.4 实验结果28-33
• 2.4.1 SjTOR基因的克隆及生物信息学分析28-31
• 2.4.2 实时定量PCR分析SjTOR在不同期别虫体中的转录差异31-32
• 2.4.3 SjTOR蛋白的组织定位32-33
• 2.5 讨论33-34
• 第三章 日本血吸虫SjTOR-ed1的克隆表达及其免疫评估34-47
• 3.1 引言34
• 3.2 实验材料34-37
• 3.2.1 生物材料34
• 3.2.2 主要仪器34-35
• 3.2.3 主要酶和试剂35
• 3.2.4 试剂配制35-37
• 3.3 实验方法37-41
• 3.3.1 SjTOR-ed1片段的克隆、表达及纯化37-39
• 3.3.2 Western Blot检测重组蛋白的免疫原性39
• 3.3.3 重组蛋白rSjTOR-ed1动物免疫保护效果评估39-40
• 3.3.4 ELISA检测特异性抗体水平40-41
• 3.4 实验结果41-45
• 3.4.1 SjTOR-ed1片段的扩增及重组质粒pET-28a-SjTOR-ed1的构建41
• 3.4.2 重组蛋白rSjTOR-ed1的表达及纯化41-42
• 3.4.3 重组蛋白rSjTOR-ed1的免疫原性分析42-43
• 3.4.4 重组蛋白rSjTOR-ed1诱导的免疫保护效果评估43-44
• 3.4.5 抗rSjTOR-ed1特异性抗体水平的检测44-45
• 3.5 讨论45-47
• 第四章 SjTOR-ed1的功能研究及RNA干扰分子的筛选47-55
• 4.1 引言47
• 4.2 实验材料47-49
• 4.2.1 主要仪器47
• 4.2.2 生物材料及主要试剂47-48
• 4.2.3 试剂配制48-49
• 4.3 实验方法49-51
• 4.3.1 绵羊红细胞溶血试验49-50
• 4.3.2 重组蛋白rSjTOR-ed1与补体C2的结合试验50
• 4.3.3 日本血吸虫TOR特异RNA干扰分子的筛选50-51
• 4.4 实验结果51-53
• 4.4.1 重组蛋白rSjTOR-ed1可以抑制补体溶血并可结合补体C251-52
• 4.4.2 日本血吸虫TOR基因特异RNA干扰分子的筛选52-53
• 4.5 讨论53-55
• 第五章 全文总结55-56
• 参考文献56-61
• 致谢61-62
• 作者简历62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 卞国武,余新炳,吴忠道,徐劲,周俊梅,单志新,马长玲,邵筱;日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因的原核表达[J];中国血吸虫病防治杂志;2001年06期

2 姜宁;尹继刚;胡哲;张嘉保;陈启军;;血吸虫基因组及疫苗的研究进展[J];中国基础科学;2007年04期

3 李石柱;郑浩;高婧;张利娟;朱蓉;许静;郭家钢;肖宁;周晓农;;2012年全国血吸虫病疫情通报[J];中国血吸虫病防治杂志;2013年06期

  本文关键词：日本血吸虫TOR基因克隆表达及生物学功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：426345