MALAT1在LPS诱导的炎症反应中的功能与机制研究

发布时间：2017-06-07 12:01

  本文关键词：MALAT1在LPS诱导的炎症反应中的功能与机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：越来越多的研究结果显示长链非编码RNA在许多生理和病理过程中发挥非常重要的作用。MALAT1是一个在哺乳动物高度保守的lncRNA,主要与肿瘤的发生发展相关,目前不清楚它是否参与免疫反应。本课题旨在揭示MALAT1在炎症应答反应中的作用及机制,进一步丰富lncRNA在炎症反应中的调控作用。方法：为了验证MALAT1在炎症反应中的作用,我们主要以PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞为研究对象,qPCR检测了经TLR4 (Toll-like receptor 4)配体LPS (Lipopolysaccharide)刺激后THP-1巨噬细胞中MALAT1的表达变化。我们通过qPCR及ELISA实验检测了siRNA敲减MALAT1后对炎症因子TNFαβIL-6和IL-1p表达的影响。我们进行了NF-κB报告基因实验,检测MALAT1对NF-κB活性的影响。通过qPCR以及Western blot检测了MALAT1对p50、p65表达丰度的影响以及ChlP-qPCR检测了敲减MALAT1对NF-κB与靶基因TNFα、IL-6和IL-1p启动子结合的影响来确定MALAT1调节NF-κB活性的机制。通过RIP实验检测了MALAT1与NF-κB的结合情况。为了验证NF-κB对MALAT1的转录调控,我们做了NF-κB抑制剂实验检测了NF-κB对LPS诱导的MALAT1表达的作用。通过构建MALAT1不同启动子片段的报告质粒以及候选NF-κB位点突变质粒进行报告基因实验验证MALAT1启动子上是否存在NF-κB结合位点。最终通过ChIP检测NF-κB与MALAT1启动子的结合。结果：我们发现LPS能够诱导MALAT1的表达,此外siRNA敲减MALAT1后促进了炎症因子TNFα、IL-6的表达,而对IL-1β的表达没有影响。NF-κB报告基因实验结果显示MALAT1能够抑制NF-κB活性。然而,我们发现MALAT1不影响p50和p65的表达丰度。通过ChIP,RIP实验以及对MALAT1在细胞中分布情况的分析,我们发现MALAT1在细胞核中与NF-κB的亚基p50、p65结合,抑制了NF-κB与TNFα和IL-6启动子的结合。此外,我们发现NF-κB的抑制剂抑制了LPS诱导的MALAT1转录,暗示LPS诱导的MALAT1的转录依赖于NF-κB。我们还在MALAT1启动子上确认了一个NF-κB的保守结合位点。ChIP-qPCR实验证明了NF-κB与MALAT1启动子结合,表明NF-κB对MALAT1的转录调控。结论：我们发现LPS诱导巨噬细胞中MALAT1的表达,并发现MALAT1通过结合NF-κB亚基P50、p65抑制NF-κB与靶基因启动子的结合,最终抑制TNFαβIL-6的表达。此外LPS诱导的MALAT1的表达也受到NF-κB的转录调控。因此MALAT1是NF-κB活性的负反馈调控因子,帮助严格调控TLR信号通路,避免过度的炎症反应。
【关键词】：长链非编码RNA MALAT1 固有免疫 NF-κB 炎症
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-11
• 主要英文缩略词11-12
• 前言12-13
• 文献综述 长链非编码RNA在免疫反应中的研究进展13-24
• 1. LncRNA的简介13-14
• 2. LncRNA的作用机制14-16
• 2.1 LncRNA在表观遗传水平调控基因的表达15
• 2.2 LncRNA在转录水平调控基因的表达15
• 2.3 LncRNA在转录后水平调节基因的表达15-16
• 3. LncRNA与免疫细胞的分化与成熟16-18
• 3.1 LncRNA与T淋巴细胞16-17
• 3.2 LncRNA与B淋巴细胞17
• 3.3 LncRNA与树突状细胞17-18
• 3.4 LncRNA与粒细胞18
• 3.5 LncRNA与巨噬细胞18
• 4. LncRNA与免疫反应18-21
• 4.1 LncRNA与固有免疫反应18-20
• 4.2 LncRNA与适应性免疫20-21
• 4.3 LncRNA与抗病毒免疫21
• 5. LncRNA与免疫疾病21-23
• 5.1 LncRNA与类风湿关节炎21-22
• 5.2 LncRNA与川崎病22
• 5.3 LncRNA与系统性红斑狼疮22-23
• 5.4 LncRNA与甲型流感23
• 6. 总结与展望23-24
• 第一章 材料与方法24-38
• 1. 材料24-27
• 1.1 细胞株24
• 1.2 实验仪器24
• 1.3 主要试剂24-25
• 1.4 试剂配制25-27
• 2. 实验方法27-38
• 2.1 细胞的培养27
• 2.2 LPS诱导巨噬细胞的炎症反应27
• 2.3 siRNA转染27-28
• 2.4 总RNA提取与qPCR28-29
• 2.5 ELISA检测细胞培养上清中的TNFα、IL-6和IL-1β29-30
• 2.6 Western Blot30-31
• 2.7 双荧光素酶实验31
• 2.8 染色质免疫共沉淀ChIP31-33
• 2.9 MALAT1启动子报告基因质粒的构建33
• 2.10 RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)33-35
• 2.11 细胞核和细胞质RNA的分离35
• 2.12 DNA-pulldown实验35
• 2.13 统计学分析35-38
• 第二章 实验结果38-45
• 1. 与炎症相关的lncRNA的筛选38-39
• 2. LPS诱导巨噬细胞中MALAT1的表达39-40
• 3. MALAT1调节LPS诱导的炎症因子的表达40
• 4. MALAT1抑制NF-κB活性40-42
• 5. MALAT1通过与NF-κB结合调节炎症因子的表达42-43
• 6. LPS诱导的MALAT1的表达依赖于NF-κB43-45
• 第三章 讨论45-47
• 小结47-48
• 致谢48-49
• 参考文献49-55
• 作者简介55

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