低氧损伤下PC12细胞自噬与凋亡的关系研究

发布时间：2017-06-07 15:10

  本文关键词：低氧损伤下PC12细胞自噬与凋亡的关系研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分低氧损伤诱导PC12细胞自噬激活目的初步探讨在低氧损伤下神经元样肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)自噬的发生情况。方法通过低氧培养箱建立细胞低氧损伤模型;构建GFP-LC3质粒;分别在给予或者不给予溶酶体质子泵抑制剂Baf A1的情况下,通过western blot法检测自噬相关蛋白的表达;RT-PCR法检测自噬小体表面微管相关蛋白1轻链3(LC3)m RNA水平的表达;激光共聚焦显微镜检测LC3的表达及分布变化。统计学分析低氧损伤与细胞自噬之间的关系。结果western blot结果显示,低氧损伤下,PC12细胞自噬相关蛋白的表达明显随着低氧时间的延长而增加,24小时后出现下降;RT-PCR结果显示,低氧损伤下,LC3的m RNA水平明显上调;激光共聚焦显微镜检查结果显示,低氧损伤下,细胞内含有GFP-LC3颗粒的自噬小体明显增多。自噬的发生与低氧损伤之间存在相关性。结论低氧损伤能诱导PC12细胞发生自噬,两者之间存在相关性。第二部分自噬激活在低氧损伤中的作用及其机制目的以对低氧敏感的神经元样PC12细胞为低氧损伤模型,探讨低氧诱导的自噬激活在低氧损伤中发挥的作用及其机制。方法通过低氧培养箱建立细胞低氧损伤模型;体外给予细胞自噬抑制剂3-MA,通过MTT方法检测细胞活力;LDH法检测细胞毒性;PI染色检测细胞死亡情况;caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3的活性;western blot方法检测caspase-3的活性形式cleaved caspase-3的表达变化。统计学分析低氧损伤下抑制细胞自噬后细胞活力及凋亡变化及其相关性。结果MTT结果显示给予自噬抑制剂3-MA后,低氧损伤的细胞活力进一步降低;LDH结果显示给予自噬抑制剂3-MA后,低氧损伤的细胞细胞毒性进一步增强;PI染色结果显示给予自噬抑制剂3-MA后,低氧损伤的细胞死亡进一步增多;并且caspase-3的活性及活性形式表达检测结果显示,给予自噬抑制剂3-MA后,caspase-3的活性增强,其活性表达形式cleaved caspase-3的表达增多。结论低氧损伤下,自噬发挥细胞保护作用,这种保护作用可能与抑制凋亡有关。第三部分凋亡抑制自噬活动目的低氧损伤24小时后自噬活动逐渐减弱,而凋亡活动逐渐增强。凋亡对自噬是否影响及其可能的机制尚不完全明了。本研究目的是初步探讨低氧损伤的后期凋亡的增强是否导致自噬的减弱,两者之间是否存在相关性。方法通过低氧培养箱建立细胞低氧损伤模型;构建Flag-Bax WT,Flag-Bax S184V和Flag-BaxΔC过表达质粒;将EGFP-LC3分别与Flag-Bax WT(或Flag-Bax S184V,Flag-BaxΔC)共转染细胞,western blot检测自噬相关蛋白的变化;给予细胞凋亡抑制剂z-VAD-FMK,蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂氯喹,western blot检测共转细胞内LC3表达的变化;细胞低氧时给予细胞凋亡抑制剂z-VAD-FMK,western blot检测LC3表达的变化。结果western blot结果显示,当EGFP-LC3与野生型Flag-Bax WT或激活性Flag-Bax S184V质粒共转时其表达明显减少,而与突变型Flag-BaxΔC质粒共转则没有此现象;给予凋亡抑制剂z-VAD-FMK能部分逆转野生型Flag-Bax WT(或Flag-Bax S184V)过表达导致的LC3表达减少的情况;细胞低氧时给予细胞凋亡抑制剂z VAD,能抑制LC3表达的减少。结论低氧24小时后凋亡激活能抑制自噬功能,过表达Bax诱导的凋亡能抑制自噬功能,可能与caspase降解LC3蛋白有关,两者之间存在相关性。
【关键词】：PC12细胞 低氧 自噬 自噬 保护 凋亡 自噬 凋亡 caspase
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-14
• 中英文缩写索引14-16
• 绪论16-19
• 第一部分 低氧损伤诱导PC12细胞自噬激活19-40
• 引言19-20
• 1 材料与方法20-32
• 2 结果32-37
• 3 讨论37-39
• 4 结论39-40
• 第二部分 自噬激活在低氧损伤中的作用及其机制40-51
• 引言40
• 1 材料与方法40-44
• 2 结果44-49
• 3 讨论49-50
• 4 结论50-51
• 第三部分 凋亡抑制自噬活动51-59
• 引言51
• 1 材料与方法51-54
• 2 结果54-57
• 3 讨论57-58
• 4 结论58-59
• 参考文献59-64
• 致谢64-66
• 攻读硕士期间发表的论文66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：429435