重组人肝活素（HPS）的受体分离和确认研究

发布时间：2017-06-09 03:07

  本文关键词：重组人肝活素（HPS）的受体分离和确认研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝活素(hepassocin,HPS),又名肝细胞衍生纤维蛋白原相关蛋白1(Hepatocyte-derived Fibrinogen-Related Protein 1)或类纤维蛋白原1(Fibrinogen-Like 1,FGL1),是一种肝脏特异性的促有丝分裂因子,并在肝部分切除、四氯化碳(CCl4)、D-氨基半乳糖(D-galN)等诱导的肝损伤修复中起重要作用。我们前期的研究表明HPS以表皮生长因子受体(EGFR)依赖方式激活MAPK信号通路并介导促进正常肝细胞增殖作用,但有关是否存在HPS特异受体及其受体分子还知之甚少。本研究在实验室前期通过CHO细胞表达系统制备重组HPS的基础上,建立了重组人HPS体外生物学活性测定方法,证实获得高活性的重组HPS。进而采用免疫荧光实验和受体结合实验证实肝源细胞存在HPS特异受体。采用蛋白质组学技术我们发现ANXA2分子是HPS受体候选分子,进一步我们通过多种方法证实ANXA2分子参与HPS膜信号的传递,表明ANXA2分子至少是HPS受体成分之一。这些研究结果为研究HPS介导的信号途径及其在严重肝病治疗中的应用提供了基础。前期实验室已成功构建了CHO-HPS表达细胞系,并获得多批次HPS样品,本研究验证了重组HPS的理化性质和纯度,证实获得高纯度HPS。进一步,我们通过优化实验条件,建立了基于EdU掺入的促肝细胞增殖及基于乳酸脱氢酶释放的肝细胞保护两种体外HPS生物活性检测方法。实验结果表明重组HPS以剂量依赖方式促进肝细胞增殖,抑制CCl4诱导的乳酸脱氢酶释放,表明我们获得了高纯度高活性的重组HPS,可用于HPS受体及其信号途径和HPS功能等研究。这两种方法操作简单、重复性好,较好地反映了HPS体内通过促进肝细胞增殖、抑制肝细胞坏死救治急性肝损伤小鼠的活性,可用于重组HPS体外生物学活性的评价,为重组HPS质量控制和研究HPS的功能奠定基础。为证实细胞膜上是否存在HPS特异受体,我们首先采用FITC荧光标记HPS,并通过免疫荧光实验观察HPS是否能与肝细胞膜结合,结果发现FITC标记的HPS可特异结合在L02肝细胞膜部位,提示L02细胞存在HPS特异结合受体。为验证这一结果,我们采用经典的碘标法标记HPS,体外生物活性检测表明125I-标记的HPS保持了促进肝细胞增殖的活性,提示I-标记没有破坏HPS的空间结构。受体结合实验结果发现HPS与L02人肝细胞、HepG2人肝癌细胞及小鼠原代肝细胞的结合呈现典型的受体与配体的结合动力学方式,L02细胞的饱和浓度为1546.32ng/mL,HepG2细胞的饱和浓度为2753.84ng/m L,小鼠肝实质细胞的饱和浓度为2242.76ng/ml。l02细胞、hepg2细胞、小鼠原代肝细胞表面hps受体数目分别为3.1×105sites/cell、1.8×105sites/cell和4.8×105sites/cell。小鼠原代肝实质细胞受体数量较多,可能与该细胞体积比较大有关。scatchard分析结果显示,三种肝源细胞只存在一种hps受体。hps与l02细胞、hepg2细胞、小鼠原代肝细胞的结合常数依次为6.71pmol/l、7.7nmol/l和2.17nmol/l。竞争实验表明,高倍浓度非标的hps能够有效竞争125i-hps与细胞的结合,符合受体配体间的竞争曲线。这些结果表明上述肝源细胞存在hps特异膜受体。检测125i-hps与非肝源细胞a549、hela、ea926细胞的结合发现,hps与受体的结合具有肝特异性。用高浓度egf、hgf不能竞争hps与肝细胞的结合,说明hps受体不同于egf和hgf受体。进一步,我们用配体与受体交联实验也证实hps特异受体的存在。放射自显影结果表明125i-hps与受体形成的复合体大小约为110kd,已知hps的单体去除n端信号肽后分子量为34kd,二聚体是其发挥活性的构象,分子量大小为68kd,因此推测hps受体的分子量约为42kd。为确认hps的受体分子,我们采用蛋白质组技术鉴定了hps刺激后细胞膜蛋白质磷酸化的变化,结果发现hps刺激l02细胞显著诱导40kd左右的酪氨酸磷酸化蛋白带,对这一条带进行质谱鉴定,得到4个候选蛋白,通过对候选蛋白质组织分布、细胞定位、功能分析等综合判断,我们推测anxa2分子可能为hps的受体。进一步,我们验证了hps可诱导anxa2发生酪氨酸磷酸化,hps可与anxa2在细胞膜共定位并发生相互作用;采用rna干涉下调anxa2表达,显著降低125i-hps与l02细胞的结合;下调anxa2表达抑制了hps诱导的egfr磷酸化和mapk通路的活化,并抑制了hps促进l02细胞增殖和降低ccl4诱导肝细胞损伤的活性。这些实验结果表明anxa2是hps信号通路的关键分子,参与了hps与肝源细胞的结合过程,是hps受体或者至少是hps受体的组成部分。我们还通过同源建模的方法建立了hps的三维结构,通过对模型进行优化,最终建立了一个高质量的hps三维结构模型。将此模型与anxa2进行刚性对接,并结合构型进行多重优化,获得hps与anxa2最佳的结合构型。anxa2与hps相互作用的残基为:phe72、gln69、met11。与之对应的hps作用的残基为:glu59、leu55、lys65。hps受体的确认对阐明hps信号通路、功能及在严重肝病治疗中的作用等多个方面具有重要意义,同时,hps受体也可能成为肝脏疾病的靶点,用于新药的研发。虽然本实验初步确认anxa2参与hps与细胞结合的过程,但anxa2缺乏严格的肝组织特异性,不能从组织分布的角度解释hps特异促进肝细胞增殖的作用机制,此外,我们前期的研究表明HPS刺激肝细胞增殖依赖于EGFR的活化,ANXA2已被报道可与EGFR发生相互作用并调控其活化,因此,下一步我们需要研究HPS-ANXA2-EGFR-MAPK在HPS信号通路及生物学功能中的作用,特别是肝脏特异选择的作用机制。
【关键词】：肝活素 膜连蛋白 放射性碘 受体研究
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R3416
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-16
• 第一章 材料与方法16-26
• 1.1 实验材料与试剂16
• 1.1.1 细胞系16
• 1.1.2 实验动物16
• 1.1.3 主要试剂16
• 1.2 实验方法16-26
• 1.2.1 细胞培养条件16-17
• 1.2.2 HPS体外活性方法测定的建立17-18
• 1.2.3 FITC荧光标记重组人肝活素HPS18
• 1.2.4 FITC-HPS与L02细胞的结合18
• 1.2.5 125I标记HPS18
• 1.2.6 受体饱和实验18-19
• 1.2.7 受体竞争实验19
• 1.2.8 小鼠原代肝实质细胞的分离19
• 1.2.9 BS3交联法19
• 1.2.10 125I放射自显影19-20
• 1.2.11 EGF、HGF与 125I-HPS竞争实验20
• 1.2.12 细胞膜蛋白提取20
• 1.2.13 细胞总蛋白提取20-21
• 1.2.14 免疫印迹实验（Western Blot）21
• 1.2.15 免疫共沉淀（CoIP）21
• 1.2.16 RNA提取及Real time PCR检测21-22
• 1.2.17 细胞质粒转染22
• 1.2.18 小RNA转染22
• 1.2.19 间接免疫（荧光共聚焦）22
• 1.2.20 统计学分析22
• 1.2.21 HPS的同源建模22-24
• 1.2.22 HPS与ANXA2的对接研究24
• 1.2.23 模型优化及分子动力学模拟24
• 1.2.24 丙氨酸突变扫描24-26
• 第二章 结果与讨论26-62
• 2.1 重组人肝活素（HPS）的鉴定26-33
• 2.1.1 重组人肝活素（HPS）的理化性质及纯度鉴定26-27
• 2.1.2 重组人肝活素（HPS）的生物学活性鉴定27-33
• 2.2 重组人肝活素（HPS）肝源性细胞特异受体的鉴定33-59
• 2.2.1 重组人肝活素（HPS）存在肝源性细胞特异性受体33-42
• 2.2.2 重组人肝活素（HPS）受体鉴定42-48
• 2.2.3 重组人肝活素（HPS）通过ANXA2发挥生物学功能48-51
• 2.2.4 HPS与ANXA2在膜上共定位51-52
• 2.2.5 HPS与ANXA2存在相互作用52-53
• 2.2.6 生物信息学模拟HPS与ANXA2相互作用53-59
• 2.3 讨论59-62
• 总结62-63
• 一、主要研究成果62
• 二、论文创新点62
• 三、下一步工作计划62-63
• 附录63-75
• 一、英文缩略词表63-64
• 二、主要仪器设备64-65
• 三、常用试剂、培养基的配制65-67
• 三、SDS-PAGE进行分子量的测定分析67
• 四、电喷雾质谱蛋白质分子量的测定分析67-68
• 五、固相pH梯度（ IPG）等电聚焦法(Bio-Rad手册)68
• 六、氨基酸序列分析方法（ OPA法）68-70
• 七、Edman降解蛋白质N-末端氨基酸序列分析方法70-71
• 八、C-末端氨基酸序列分析（ 质谱法）71-73
• 九、二硫键定性分析73-75
• 参考文献75-80
• 个人简历80-81
• 致谢81

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张碧群,陈朝汉,李琼芳,朱春华;491例健康成人肝、胆、脾B型超声波测值报告[J];职业医学;1989年03期

2 张凯，谭武红，，徐光禄;人肝谷胱甘肽过氧化物酶的纯化及部分性质研究[J];地方病通报;1994年02期

3 周润琦,江华,王蓓,黄祥贤,陈石根;正常及癌变人肝组织中某些酶测定[J];自然杂志;1987年11期

4 叶捷庆,侯惠珍,傅成芬;成人肝间叶性错构瘸一例[J];河南肿瘤学杂志;1999年02期

5 周良楣;牛明耀;徐大毅;张东友;;100例健康人肝血流图分析[J];山西医药杂志;1981年02期

6 ;第二节 老年人肝、胆、胰疾病的特点[J];成都医药;1984年04期

7 徐蘅，裘奇，胡梅清;人肝谷胱甘肽过氧化物酶的动力学性质[J];南京铁道医学院学报;1994年04期

8 胡US仁;W人肝固有动

本文编号：434308