PNPase对铜绿假单胞菌毒力以及sRNA稳定性的研究

发布时间：2017-06-10 22:18

  本文关键词：PNPase对铜绿假单胞菌毒力以及sRNA稳定性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：铜绿假单胞菌是一种适应性强代谢通路复杂的革兰氏阴性菌。作为一种条件致病菌。铜绿假单胞菌具有多种毒力因子,可以引起急性感染和慢性感染两种感染类型。在急性感染中,三型分泌系统(T3SS)和运动能力发挥着重要的作用。而在慢性感染过程中,生物被膜可以保护细菌受到宿主免疫系统的清除。另外,高水平的六型分泌系统(T6SS)的表达是慢性感染的一个明显特征。在铜绿假单胞菌中,存在两个小RNA,RsmY和RsmZ(RsmY/Z),会竞争性调节急性感染以及慢性感染的毒力因子。多核苷酸磷酸化酶(PNPase)是由N端的核心功能区以及C端的RNA结合区KH-S1组成。迄今,已经发现PNPase主要通过三种方式来控制基因的表达:降解mRNA,影响sRNA稳定性以及影响翻译。在前期的研究中,我们发现转座子插入到pnp基因会引起铜绿假单胞菌T3SS表达的缺失。本项工作深入探究了PNPase调控基因表达的机理。首先,我们验证了PNPase的KH-S1区对于T3SS以及细菌毒力是必须的。接着我们进行了转录组测序,发现PNPase在基因调控上具有多种功能。值得注意的是,在ΔKH-S1菌株中,我们发现调节因子exsA的RNA水平有明显的降低,进而影响了三型分泌系统的表达。在ΔKH-S1中,我们发现四型菌毛水平的降低以及T6SS的上调均是由RsmY/Z水平的升高引起的。进一步的实验表明,敲除KH-S1也不会影响RsmY/Z的转录,但是会增加了sRNA的稳定性。菌体内的RNA富集以及体外的EMSA实验均证明了,KH-S1片段和RsmY/Z有直接的结合作用。综上所述,我们的研究表明,PNPase对于调控铜绿假单胞菌毒力以及控制sRNA的稳定性具有重要的作用。
【关键词】：PNPase 毒力 RsmY/Z 稳定性
【学位授予单位】：南开大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-22
• 第一节 铜绿假单胞菌的生物特性以及毒力因子10-15
• 1.1.1 铜绿假单胞菌的生物特性10-11
• 1.1.2 铜绿假单胞菌的毒力因子11-13
• 1.1.3 三型分泌系统（T3SS）与六型分泌系统（T6SS）13-15
• 第二节 铜绿假单胞菌毒力因子的调控15-17
• 1.2.1 Gac/Rsm通路（双组份系统）15-16
• 1.2.2 铜绿假单胞菌中的调控sRNA16-17
• 第三节 多核苷酸磷酸化酶（Polynucleotide phosphorylase, PNPase）17-20
• 1.3.1 PNPase的结构与功能单位17-18
• 1.3.2 PNPase的研究现状18-20
• 第四节 本文研究目的意义以及技术线路20-22
• 1.4.1 本文研究目的意义20-21
• 1.4.2 本文研究的技术线路21-22
• 第二章 材料与方法22-45
• 第一节 材料与试剂22-27
• 2.1.1 实验菌株与质粒22-24
• 2.1.2 RT-PCR引物序列24-25
• 2.1.3 实验试剂与仪器25-27
• 第二节 实验方法27-45
• 2.2.1.微量质粒的提取27
• 2.2.2.细菌基因组的提取27-28
• 2.2.3.PCR，，特异性片段扩增28-29
• 2.2.4. 酶切和连接体系29-30
• 2.2.5. E.coli化学感受态细胞转化30
• 2.2.6. 铜绿假单胞菌转化感受态细胞的制备与转化30-31
• 2.2.7.β-半乳糖苷酶活性的测定31
• 2.2.8.敲除菌株的构建31-33
• 2.2.9.Western blot33-34
• 2.2.10 细菌RNA提取34-35
• 2.2.11 RNA反转录为cDNA35-36
• 2.2.12 Real-Time PCR36-37
• 2.2.13 点突变菌株的构建37-38
• 2.2.14 免疫共沉淀38-39
• 2.2.15 细胞毒性检测39
• 2.2.16 小鼠肺部急性感染模型39-40
• 2.2.17 蛋白纯化40-41
• 2.2.18 RNA的体外转录41-42
• 2.2.19 RNA EMSA实验42-43
• 2.2.20 RNA稳定性分析43
• 2.2.21 蹭行运动检测（Twitching motility）43-44
• 2.2.22 细菌的最低抑菌浓度（MIC）的测定44-45
• 第三章 实验结果与分析讨论45-67
• 第一节 pnp是铜绿假单胞菌的必需基因45-48
• 3.1.1 pnp是铜绿假单胞菌的必需基因45-46
• 3.1.2 pnp缺失菌株的构建46-48
• 第二节 PNPase影响铜绿假单胞菌三型分泌系统及急性感染48-53
• 3.2.1 PNPase会影响三型分泌系统的表达48
• 3.2.2 PNPase影响铜绿假单胞菌细胞毒性以及小鼠肺部定植48-50
• 3.2.3 PNPase的KH和S1结构域对于毒力的影响50-52
• 3.2.4 exsA的过表达可以回补T3SS的缺失52-53
• 第三节 PNPase影响多个基因的表达53-56
• 第四节 铜绿假单胞菌多种毒力因子的变化56-59
• 3.4.1 PNPase影响铜绿假单胞菌的蹭行能力56
• 3.4.2 PNPase影响铜绿假单胞菌的六型分泌系统T6SS56-59
• 第五节 PNPase通过影响sRNA进一步调控毒力因子59-62
• 3.5.1 Gac-Rsm双组份系统的表达变化59-60
• 3.5.2 sRNA RsmY/Z的表达水平以及作用60-62
• 第六节 PNPase会直接作用于sRNA62-67
• 3.6.1 PNPase影响sRNA RsmY/Z的稳定性62-64
• 3.6.2 PNPase可以和sRNA RsmY/Z直接结合64-67
• 第四章 结论与讨论67-69
• 参考文献69-76
• 致谢76-77
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与科研成果77

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