抗CD163兔单克隆抗体的开发及鉴定

发布时间：2017-06-30 06:15

  本文关键词：抗CD163兔单克隆抗体的开发及鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景抗体被广泛应用于生物科学和制药等行业中。其中,鼠单克隆抗体由于在特异性、亲和力等方面较多克隆抗体更具优势,其发展和起步较兔单克隆抗体早,因此在研究、诊断和治疗等领域占据了主导地位。然而,兔单克隆抗体以其更高的特异性、亲和力及易于人源化等优势,不仅为科学界提供了更优的选择,也为诊断和治疗领域提供了新的机遇。CD163,又名M130,为I型跨膜蛋白,属于B族富半胱氨酸清道夫(SRCR)家族成员,特异性表达于单核细胞和巨噬细胞,可被免疫抑制剂糖皮质激素和IL-10诱导表达。目前已知CD163具有多种重要功能：介导单核细胞结合到细菌上,导致炎性细胞因子释放；参与循环清除触珠蛋白和血红蛋白复合物以及游离血红蛋白；可以介导单核细胞与成红细胞粘附,促进红细胞的扩张；结合并内化TWEAK细胞因子,当动脉粥样硬化发生时,sCD163和TWEAK在血浆中的比例将会提高。研究亦发现CD163在自身免疫性疾病、肿瘤、肝衰竭等方面具有较好的临床价值和应用前景。目的制备多应用、高亲和力、特异性CD163兔单克隆抗体。方法通过设计合成一条特异性免疫原免疫兔子,利用改进的兔杂交瘤技术制备CD163抗体。通过ELISA、WB、 IHC-P、ICC等方法实现多抗血清和杂交瘤上清的初筛,筛选得到的最佳阳性杂交瘤的重链、轻链基因经过克隆和表达,重组抗体通过ELISA、WB、IHC-P、 IHC-Fr等方法验证,其中WB和IHC-P检测结合文献描述,增加了阴性细胞和组织作为有效的特异性验证手段。结果本课题共筛选到ELISA阳性克隆68个,其中8个为WB阳性克隆,这8个克隆在多个阳性裂解液中可检测到分子量约为150kDa的目的条带,并且在文献报道阴性细胞或组织裂解液中呈阴性结果。其中编号23号克隆还可应用于其他物种(人和大鼠),并且在IHC-P、IHC-Fr的检测中显示了良好的组织特异性作为最佳克隆进入生产。结论我们成功开发了一个能应用于多物种(人、小鼠和大鼠)、具备多种应用(ELISA、WB、IHC-P、 IHC-Fr)的特异性CD163兔单克隆抗体,填补了商品化优质CD163兔单克隆抗体的空白,具有很好的市场竞争力,将为研究、诊断和治疗等领域提供新机遇。
【关键词】：兔单克隆抗体 CD163 重组抗体
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-7
• ABSTRACT7-9
• 主要缩略词9-14
• 第一章 绪论14-21
• 1.1 抗体14-16
• 1.1.1 抗体的历史14-15
• 1.1.2 抗体的结构15-16
• 1.1.3 抗体的应用16
• 1.1.4 抗体的分类16
• 1.2 CD163及其研究现状16-21
• 1.2.1 CD163分子特征17-18
• 1.2.2 CD163的表达和调节18
• 1.2.3 CD163的生物学功能18-20
• 1.2.4 CD163在临床中的应用20
• 1.2.5 展望20-21
• 第二章 兔多抗血清的制备及鉴定21-33
• 2.1 实验材料21-24
• 2.1.1 免疫原21-22
• 2.1.2 实验动物(组织)22
• 2.1.3 主要实验器材22-23
• 2.1.4 主要试剂及配置23-24
• 2.2 实验方法24-29
• 2.2.1 免疫24-25
• 2.2.2 多抗血清的亲和纯化25
• 2.2.3 抗血清效价测定25-26
• 2.2.4 Western blot检测26-29
• 2.3 实验结果29-32
• 2.3.1 兔抗血清效价29-30
• 2.3.2 抗血清Western blot结果30-32
• 2.4 本章小结32-33
• 第三章 杂交瘤细胞的制备和筛选33-48
• 3.1 实验材料34-37
• 3.1.1 细胞来源34
• 3.1.2 主要器材及设备34-35
• 3.1.3 主要试剂及配置35-37
• 3.1.3.1 主要试剂35-37
• 3.2 实验方法37-45
• 3.2.1 细胞融合37-38
• 3.2.2 杂交瘤细胞筛选38-45
• 3.3 实验结果45-47
• 3.3.1 细胞融合结果45
• 3.3.2 ELISA结果45-46
• 3.3.3 Western Blot结果46
• 3.3.4 IHC结果46-47
• 3.3.5 ICC结果47
• 3.4 本章小节47-48
• 第四章 重组CD163抗体的制备和鉴定48-61
• 4.1 实验材料48-50
• 4.1.1 细胞、质粒来源48
• 4.1.2 主要器材及设备48-49
• 4.1.3 主要试剂及配置49-50
• 4.2 实验方法50-56
• 4.2.1 杂交瘤细胞mRNA的提取及CD163基因重链、轻链的扩增50-52
• 4.2.2 PCR产物的回收52-53
• 4.2.3 质粒构建及酶切鉴定53-55
• 4.2.4 重组CD163质粒转染55-56
• 4.2.5 重组抗体生产及鉴定56
• 4.3 实验结果56-60
• 4.3.1 HC和LC PCR结果56-57
• 4.3.2 HC质粒和LC质粒酶切结果57
• 4.3.3 重组CD163兔单克隆抗体质检结果57-60
• 4.4 本章小结60-61
• 第五章 结论与展望61-62
• 参考文献62-66
• 作者简介66

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