利用转基因小鼠筛选全人源炭疽致死因子中和抗体

发布时间：2017-07-05 11:13

  本文关键词：利用转基因小鼠筛选全人源炭疽致死因子中和抗体

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【摘要】：炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的严重威胁人类健康的传染病,在世界范围内具有广泛的分布。我国传染病防治法将其列为乙类传染病。依据感染途径不同,炭疽可分为皮肤炭疽、胃肠炭疽和肺炭疽三种类型。肺炭疽致死率高达90%以上,我国将其按甲类传染病进行预防和控制。炭疽芽孢杆菌的致病因子由三种毒素蛋白和一种聚-D-谷氨酰荚膜组成,其中三种毒素蛋白是致病的主要因素,这三种蛋白是:保护性抗原(protective antigen,PA)、水肿因子(edema factor,EF)和致死因子(lethal factor,LF)。三种蛋白单独存在不具有毒性,当PA与EF结合可形成水肿毒素(edema toxin,ET),PA与LF结合可形成致死毒素(lethal toxin,LT)。由于LT在感染者损伤及死亡中发挥主要作用,因此在炭疽感染晚期单纯使用抗生素治疗难以发挥疗效,治疗性中和抗体成为目前最有效的炭疽治疗药物。目前国外获得的炭疽毒素抗体多为炭疽PA抗体,美国FDA已批准瑞西巴库(人源PA单抗)用于吸入性炭疽的治疗。一旦炭疽芽孢杆菌被人为改构或PA中和表位发生突变,针对PA单一表位的抗体将可能失效,而针对LF的抗体将成为炭疽治疗的有效补充。目前文献中已报导的LF抗体多为鼠源抗体和嵌合抗体,由于鼠源单抗和嵌合单抗免疫原性高,易引起人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)反应从而很难应用于临床。全人源单抗避免了鼠源单抗免疫原性高等缺点,具有半衰期长、安全性高等优点,因此得到了广泛的应用。随着单个B细胞抗体制备技术的兴起,单细胞PCR技术被用于体外克隆和表达单个B细胞的抗体基因,单细胞PCR技术避免了多轮筛选过程,能够快速高通量获得抗体基因且保持抗体重、轻链天然配对,因此单细胞PCR技术将成为获取人源单抗的最新研究方法之一。由于LF抗原不能直接用于免疫志愿者从而获得人抗体基因,而转基因小鼠技术可以克服无疫苗免疫或病患血样等缺点,可用于直接免疫抗原,筛选全人源单克隆抗体。因此可利用转基因小鼠技术与单细胞PCR技术相结合的方法快速获得全人源抗体基因。鉴于此,本课题将利用转基因小鼠技术、流式分选技术和单细胞PCR技术,筛选全人源炭疽致死因子中和抗体。首先,制备炭疽LF毒素蛋白,用于后续免疫转基因小鼠、体外细胞毒素中和试验及体内大鼠毒素攻毒研究。通过制备及纯化LF抗原,并利用小鼠巨噬细胞J774A.1对LF的生物学活性进行评价,获得了纯度高、活性好、具有天然序列的LF,为转基因小鼠的免疫和中和抗体水平检测提供了保证。在对转基因小鼠进行免疫前,首先对其体液免疫特性进行了分析。鉴于转基因小鼠与普通小鼠免疫应答存在区别,将三只转基因小鼠作为实验组,三只普通雄性C57BL/6小鼠作为对照组。在第0、2、4周免疫LF,分别在免疫前及免疫后不同时间点对小鼠尾静脉采血,ELISA法测定血清中LF抗体滴度。结果显示,转基因小鼠抗体效价整体水平与普通C57BL/6小鼠存在差别,转基因小鼠免疫抗原后抗体效价上升速度比C57BL/6小鼠缓慢;且抗体效价低于C57BL/6小鼠。通过研究转基因小鼠的免疫特点,找到其合适的免疫方式、免疫周期对于筛选全人源单抗至关重要。将弗氏佐剂与抗原LF按比例混合并在第0、2、4周再次免疫2只转基因小鼠,在免疫前及免疫后7 d、14 d、28 d、42 d尾静脉采血。ELISA法检测血清中LF结合抗体水平,TNA法检测血清中LF中和抗体水平。由于记忆B细胞表面存在BCR受体,因此可以通过标记LF抗原特异的记忆B细胞筛选炭疽LF单克隆抗体。根据前期文献调研及实验得知,小鼠在最后一次免疫后第14天至21天记忆B细胞数量相对较多,适合进行分选。取最后一次免疫第14天的转基因小鼠脾脏,经研磨获取脾细胞悬液,对脾细胞悬液中特异的记忆B细胞进行荧光染色后,利用流式细胞仪分选获得288个记忆B细胞,经单细胞反转录PCR和巢式PCR扩增抗体基因,最终获得了48对重、轻链配对的抗体可变区基因,单细胞PCR的阳性率约为17%。通过重叠延伸PCR,构建由启动子、前导序列、抗体全长基因、多聚A尾(poly(A)tail)组成的线性表达框,构建48对抗体线性表达框基因转染至HEK293T细胞中进行表达。ELISA法对转染上清进行结合活性测定,获得结合单抗2株,分别为1D7和2B9。对其基因序列进行分析,2株LF单抗均为全人源单抗。构建LF单抗表达质粒,瞬时转染Expi 293F细胞,采用Protein A亲和层析柱对细胞上清进行纯化,对获得的2株抗体采用SPR技术测定其亲和力大小,1D7单抗亲和力高于2B9单抗。细胞毒性试验(TNA)测定2株单抗体外中和活性,两株LF单抗均对细胞起到了100%的保护作用;Fisher 344大鼠模型测定2株单抗体内中和活性,两株LF单抗均能延长大鼠存活时间。最后,本课题也对LF单抗与PA单抗的联合使用进行了探究,结果表明2株LF单抗均能与炭疽PA单抗发挥一定的协同作用,并且2株LF单抗与无保护活性的PA单抗8A7联合使用时,无论对体外细胞毒性试验还是体内大鼠攻毒试验,均可产生良好的保护效果。综上所述,本课题通过用LF抗原免疫人抗体转基因小鼠,筛选获得了抗LF的全人源单抗,同时探索了转基因小鼠的免疫特点以及单抗联合使用的效果。本课题的创新点在于利用了转基因小鼠、流式分选技术和单细胞PCR技术相结合的优势,不仅快速获得了全人源炭疽LF单克隆抗体,也为快速筛选其他全人源单克隆抗体开辟了新的思路与方法。
【关键词】：炭疽致死因子 转基因小鼠 流式分选 单细胞PCR 记忆B细胞 全人源单克隆抗体
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 主要缩略词表6-8
• 摘要8-11
• Abstract11-14
• 前言14-18
• 第一章 全人源炭疽致死因子单抗的筛选与鉴定18-48
• 第一节 炭疽毒素致死因子的制备与检测18-22
• 1. 材料和方法18-19
• 1.1 材料18
• 1.2 方法18-19
• 1.2.1 炭疽毒素LF的诱导表达及抽提18
• 1.2.2 炭疽毒素LF的纯化及纯度分析18-19
• 1.2.3 炭疽毒素LF的细胞毒性试验19
• 2. 结果19-21
• 2.1 LF纯化效果19-20
• 2.2 LF的细胞毒性分析20-21
• 3. 讨论21-22
• 第二节 转基因小鼠的免疫及体液免疫特性分析22-27
• 1. 材料和方法22-23
• 1.1 材料22
• 1.2 方法22-23
• 1.2.1 转基因小鼠的免疫及血液采集22
• 1.2.2 血清中LF结合抗体的ELISA检测22-23
• 1.2.3 TNA法检测小鼠血清LF中和抗体水平23
• 2. 结果23-26
• 2.1 转基因小鼠体液免疫特性分析23-24
• 2.2 血清中LF结合抗体水平检测24-25
• 2.3 小鼠血清LF中和抗体水平25-26
• 3. 讨论26-27
• 第三节 流式分选记忆B细胞获取LF单抗基因27-36
• 1. 材料和方法27-32
• 1.1 材料27
• 1.2 方法27-32
• 1.2.1 转基因小鼠脾细胞的分离27-28
• 1.2.2 抗原特异的记忆B细胞表面抗原的染色28
• 1.2.3 流式细胞仪分选单个抗原特异的记忆B细胞28
• 1.2.4 单细胞反转录PCR扩增抗体基因28-31
• 1.2.5 单细胞巢式PCR扩增抗体基因31-32
• 2. 结果32-34
• 2.1 转基因小鼠脾细胞的分离32
• 2.2 流式分选单个记忆B细胞32
• 2.3 LF单抗重、轻链基因的获取32-34
• 2.4 抗体基因序列分析34
• 3. 讨论34-36
• 第四节 全人源LF单克隆抗体的筛选36-48
• 1. 材料和方法36-42
• 1.1 材料36
• 1.2 方法36-42
• 1.2.1 单抗基因线性表达框的构建36-41
• 1.2.2 单抗基因线性表达框的表达41
• 1.2.3 ELISA法筛选LF结合单抗41
• 1.2.4 LF中和单抗的TNA筛选41-42
• 2. 结果42-46
• 2.1 单抗基因线性表达框构建与表达42-44
• 2.1.1 线性表达框各基因片段的扩增42-43
• 2.1.2 重叠延伸PCR构建单抗线性表达框43-44
• 2.2 单抗基因的表达与LF单抗的鉴定44-46
• 2.2.1 结合单抗的筛选44-45
• 2.2.2 中和单抗的筛选45
• 2.2.3 LF单抗基因序列比对45-46
• 3. 讨论46-48
• 第二章 全人源炭疽LF中和单抗的功能研究48-64
• 第一节 全人源LF单克隆抗体的中和活性研究48-56
• 1. 材料和方法48-50
• 1.1 材料48
• 1.2 方法48-50
• 1.2.1 LF中和单抗表达质粒的构建、表达及纯化48-49
• 1.2.2 SPR法测定LF单抗亲和力49-50
• 1.2.3 TNA法测定LF中和单抗体外中和活性50
• 1.2.4 大鼠攻毒实验测定LF中和单抗体内中和活性：50
• 2. 结果50-54
• 2.1 获取LF中和单抗50-52
• 2.1.1 LF单抗全长基因克隆至pc DNA3.4 表达质粒50-51
• 2.1.2 LF单抗的表达和纯化51-52
• 2.2 LF中和单抗的亲和力测定52-53
• 2.3 LF中和单抗的体外中和活性测定53
• 2.4 LF中和单抗的体内中和活性测定53-54
• 3. 讨论54-56
• 第二节 全人源LF单抗与PA单抗的协同作用研究56-64
• 1. 材料和方法56-57
• 1.1 材料56
• 1.2 方法56-57
• 1.2.1 LF中和单抗体外协同作用的TNA测定56-57
• 1.2.2 LF单抗和PA单抗体内协同试验57
• 1.2.3 单抗协同作用评价57
• 2 结果57-62
• 2.1 LF单抗与炭疽PA单抗 2A6的协同作用分析57-60
• 2.2 LF单抗与炭疽PA单抗 8A7的协同作用分析60-62
• 3 讨论62-64
• 结论64-66
• 参考文献66-70
• 附录 主要溶液配制70-72
• 个人简历72-73
• 致谢73

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本文编号：521720