恒定区结构域替换对TCR分子功能的影响

发布时间：2017-07-08 12:12

  本文关键词：恒定区结构域替换对TCR分子功能的影响

  更多相关文章： 嵌合型TCR 重组腺病毒 生物学功能 影响

【摘要】：目的:通过探讨T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)分子的β、α双链恒定区结构域分别被免疫球蛋白IgG的重链C1区和轻链恒定区结构域替换后,其激活下游信号分子、活化T细胞能力的变化情况来确定改造后的TCR是否具有相应的生物学功能,用以证明这种恒定区结构域改造策略不仅可以使TCR基因修饰的T细胞(TCR-T)内所产生的外源TCR分子与内源TCR分子错配情况减少,而且恒定区结构域改造的TCR分子仍然有相应的生物学功能,为改善TCR基因修饰的T细胞过继性免疫治疗提供借鉴。方法:一、穿梭质粒载体pDC315-rβ-IRES-rα的构建本实验室在前期工作中把经优势取用得到的TCR Vα12.2/Vβ7.1分子的双链恒定区结构域分别替换为IgG的轻链恒定区结构域和重链C1区,保留了两条链的抗原识别区、跨膜区和胞内区这样就形成了一种三明治形式的嵌合型TCR分子(chim-TCR),并利用IRES将其进行连接实现双链胞内共表达,两条链分别被黄绿色荧光蛋白和青色荧光蛋白标记后克隆到pDC315载体上(pDC315-rβYFP-IRES-rαCFP),经过FRET分析表明其可以抑制杂合TCR分子的产生。为研究这种嵌合型TCR分子是否和野生型TCR分子一样具有相应的生物学功能,首先需要去除两种荧光蛋白,以防止其对rβ、rα功能的影响。我们以载体pDC315-rβYFP-IRES-rαCFP为基础,扩增嵌合型TCR分子双链rβ及IRES-rα,通过EcoRI、Nhe I的酶切、连接反应构建过渡载体pDC315-rβ;然后对pDC315-rβ及IRES-rα进行NheI、Sal I双酶切,并连接为重组嵌合型腺病毒包装用穿梭质粒载体pDC315-rβ-IRES-rα,以进行后续嵌合型TCR分子生物学功能方面的研究。二、重组嵌合型腺病毒Ad5/F35-rβ-IRES-rα的构建利用Lipofectamine 2000将Ad5/F35腺病毒骨架质粒pBHGIoxdeE1Cre与穿梭质粒pDC315-rβ-IRES-rα共转染HEK-293细胞,以包装携带嵌合型TCR基因的重组腺病毒载体;将获得的病毒转染7402细胞,提取总RNA,通过RT-PCR法获得c-DNA,以c-DNA为模板进行目的基因的扩增来检测重组嵌合型腺病毒是否构建成功;将鉴定正确的重组嵌合型腺病毒大量扩增后经tcid50法检测病毒滴度;按照moi=100进行病毒转染淋巴细胞,通过流式细胞仪检测目的基因在淋巴细胞的表达情况。三、嵌合型tcr分子生物学功能的鉴定通过免疫印迹法对嵌合型tcr分子转导刺激信号、活化t细胞的能力进行检测,所检测的信号分子包括:pkc、erk、nfat的磷酸化与去磷酸化情况;通过荧光定量pcr对il-2、ifn-γ的表达水平进行分析;通过elisa检测细胞因子il-2和ifn-γ的分泌水平。结果:一、以本实验室前期构建的含有嵌合型tcr分子的重组质粒pdc315-rβyfp-ires-rαcfp为基础,成功构建了含嵌合型tcr基因的重组腺病毒穿梭质粒载体pdc315-rβ-ires-rα。二、将穿梭质粒pdc315-rβ-ires-rα和ad5/f35型腺病毒骨架质粒共转染hek-293细胞,成功包装出重组嵌合型tcr腺病毒ad5/f35-rβ-ires-rα;利用rt-pcr在重组嵌合型tcr腺病毒中检测出目的基因rβ-ires-rα;利用重组嵌合型tcr腺病毒感染淋巴细胞后,通过流式细胞术检测到嵌合型tcr分子的表达率为10%左右;tcid50法测得扩增后的重组嵌合型tcr腺病毒滴度达到1.3×108iu/ml。三、重组嵌合型腺病毒转染淋巴细胞并行特异抗体刺激,经荧光定量pcr、酶联免疫吸附法均检测到细胞因子ifn-γ的变化较之于未转染淋巴细胞组有显著性的升高,而il-2只有48小时的分泌水平于两组间具有显著性差异;蛋白免疫印迹检测到在经嵌合型tcr基因转染并接受特异抗体刺激的t淋巴细胞中,信号分子pkc、erk的磷酸化与去磷酸化情况发生明显的变化,而nfat的去磷酸化变化不明显。结论:所构建的嵌合型tcr分子以腺病毒为载体能成功转入淋巴细胞内,并得到有效表达;其激活淋巴细胞、传递活化信号至下游信号分子的能力得到有效保留;表明采用igg的轻链恒定区与重链c1区分别替换tcr的α、β链恒定区结构域的策略是可行的,从而为改善tcr基因修饰的t细胞过继性免疫治疗提供了借鉴。
【关键词】：嵌合型TCR 重组腺病毒 生物学功能 影响
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-18
• 第一部分 穿梭质粒载体的构建18-33
• 引言18
• 1.1 实验材料18-20
• 1.1.1 实验样本18
• 1.1.2 实验试剂18-19
• 1.1.3 实验仪器19-20
• 1.2 实验方法20-26
• 1.2.1 rβ 与IRES-rα 的引物设计20
• 1.2.2 重组质粒载体pDC315-rβ-IRES-rα 的构建过程20-21
• 1.2.3 rβ 及IRES-rα 的扩增21-22
• 1.2.4 PCR产物的纯化22
• 1.2.5 双酶切pDC315空载体与PCR纯化产物rβ22-23
• 1.2.6 双酶切产物胶回收23
• 1.2.7 pDC315双酶切片段和rβ 双酶切片段进行连接23-24
• 1.2.8 连接产物转化和鉴定24-25
• 1.2.9 去内毒素质粒pDC315-rβ 的提取25-26
• 1.2.10 IRES-rα 与pDC315-rβ 的双酶切26
• 1.3 结果26-29
• 1.3.1 rβ 及rα 的扩增26-27
• 1.3.2 pDC315-rβ-IRES-rα 构建结果27-29
• 1.4 讨论29-32
• 1.5 结论32-33
• 第二部分 重组嵌合型腺病毒Ad5/F35的包装、鉴定与滴度测定33-43
• 引言33
• 2.1 材料33-34
• 2.1.1 质粒、细胞和试剂33
• 2.1.2 仪器33-34
• 2.2 方法34-38
• 2.2.1 HEK-293细胞的培养34
• 2.2.2 Ad5/F35-rβ-IRES-rα 重组腺病毒的包装34-35
• 2.2.3 重组腺病毒鉴定35-36
• 2.2.4 扩大培养重组腺病毒36-37
• 2.2.5 重组腺病毒Ad5/F35-rβ-IRES-rα 的滴度测定37
• 2.2.6 流式细胞仪检测重组腺病毒载体在PBMC细胞的表达37-38
• 2.3 结果38-40
• 2.3.1 HEK-293细胞包装重组腺病毒38
• 2.3.2 重组嵌合型腺病毒Ad5/F35-rβ-IRES-rα 的鉴定38-40
• 2.4 讨论40-42
• 2.5 结论42-43
• 第三部分 嵌合型TCR分子活化T细胞能力的检测43-60
• 引言43
• 3.1 材料43-44
• 3.1.1 试剂43-44
• 3.2 实验方法44-49
• 3.2.1 细胞分组与实验处理44
• 3.2.2 Western blot检测细胞信号分子PKC、p-Erk、NFAT的磷酸化变化情况44-47
• 3.2.3 荧光定量PCR分析细胞因子在mRNA水平的变化47-48
• 3.2.4 酶联免疫吸附测定IFN-γ、IL-2 的分泌变化48-49
• 3.2.5 统计学分析49
• 3.3 结果49-54
• 3.3.1 Western Blot检测细胞内信号分子磷酸化变化结果49-52
• 3.3.2 IL-2、IFN-γ 在mRNA水平的表达变化52-53
• 3.3.3 IL-2、IFN-γ 在分泌水平的表达变化53-54
• 3.4 讨论54-59
• 3.5 结论59-60
• 参考文献60-66
• 附录一 英文缩略词表66-67
• 附录二 质粒图谱67-68
• 致谢68

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 叶嗣颖;抑制性T细胞因子抗原结合链的恒定区决定簇[J];国外医学(免疫学分册);1983年03期

2 唐昊;修清玉;陆慧琦;韩焕兴;;人IgE重链恒定区CH_4亚基的克隆、原核表达及纯化[J];免疫学杂志;2008年02期

3 唐昊;陆慧琦;韩焕兴;修清玉;;中国汉族人IgE重链恒定区CH_2-CH_4cDNA的克隆[J];第二军医大学学报;2006年10期

4 朱炳法;带γδ受体T细胞的功能及其特异性[J];国外医学(免疫学分册);1990年01期

5 王景锋;邵军军;李菁;高闪电;独军政;丛国正;林彤;常惠芸;;Asia I型口蹄疫病毒中和表位与羊IgG重链恒定区的融合表达及免疫原性测定[J];生物工程学报;2010年04期

6 ;最新专利文摘[J];生物加工过程;2005年01期

7 黄健;芝口浩智;黑木政秀;;抗CEA抗体C2-45重链恒定区的置换与活性鉴定[J];细胞与分子免疫学杂志;2006年05期

8 唐昊;修清玉;陆慧琦;韩焕兴;;中国汉族人IgE重链恒定区CH_2、CH_3及CH_4亚基cDNA的克隆[J];第二军医大学学报;2007年10期

9 姚宏震;;β_2微球旦白——基础与临床(综述)[J];锦州医学院学报;1981年02期

10 陈丽华,金伯泉;免疫球蛋白超家族分子在神经系统中的分布及功能[J];细胞生物学杂志;2000年02期

中国重要会议论文全文数据库 前2条

1 李少兵;余莉;张晓明;苏彦艳;;原钙粘蛋白α“恒定区”胞内域与钠钾ATP酶β1亚单位的特异性识别结合研究[A];中国解剖学会2013年年会论文文摘汇编[C];2013年

2 唐昊;陆慧琦;修清玉;韩焕兴;;人IgE重链恒定区CH_2-CH_4cDHA的克隆及序列测定[A];中华医学会第七次全国呼吸病学术会议暨学习班论文汇编[C];2006年

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 翟真真;雉鸡IgY重链恒定区片段的遗传及生物学功能分析[D];山东农业大学;2016年

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 苏畅;恒定区结构域替换对TCR分子功能的影响[D];广东药科大学;2016年

2 张婧;人IgMμ链恒定区各肽段的基因合成原核表达及免疫原性分析[D];安徽医科大学;2013年

3 盛巧玲;鹅IgA重链恒定区的原核表达和特异性抗体的制备与鉴定[D];东北农业大学;2013年

，

本文编号：534493