靶向EGFR隐蔽表位的免疫毒素的制备及其对肿瘤细胞的特异性杀伤

发布时间：2017-08-02 02:01

  本文关键词：靶向EGFR隐蔽表位的免疫毒素的制备及其对肿瘤细胞的特异性杀伤

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【摘要】：目的:制备靶向表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)隐蔽表位(287-302)的免疫毒素,并鉴定其生物学功能。方法:通过基因工程方法将抗EGFR(287-302)的806单链抗体(806 single-chain antibody fragment,806scFv)基因经柔性肽与铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A,PEA)的截短形式PE38KDEL连接,构建原核表达载体pET-22b-806scFv-PE38KDEL并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经纯化获得该免疫毒素融合蛋白806scFv-PE38KDEL,ELISA和流式细胞术检测其与EGFR的结合活性,间接免疫荧光检测重组免疫毒素的内化作用,CCK-8法检测806scFv-PE38KDEL对人脑胶质瘤细胞U87MG和U87MG-EGFRvⅢ、表皮癌细胞A431、乳腺癌细胞MDA-MB-468、舌癌细胞CAL-27的细胞毒性。结果:成功构建重组免疫毒素806scFv-PE38KDEL,诱导表达的蛋白806scFv-PE38KDEL以包涵体形式存在,经纯化后的纯度95%,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定为目的蛋白。806scFv-PE38KDEL能EGFRvⅢ胞外段蛋白结合,还能与外源性表达EGFRvⅢ的肿瘤细胞和高表达EGFR的肿瘤细胞相结合,而与表达低水平EGFR的肿瘤细胞不结合。806scFv介导了重组免疫毒素的内化。806scFv-PE38KDEL对靶细胞有明显的杀伤作用,对过表达EGFRvⅢ的U87MG-EGFRvⅢ细胞IC50值为(5.85±0.03)ng/ml,对EGFR高表达细胞MDA-MB-468、A431、CAL-27的IC50值分别为(162.80±0.06)、(75.72±0.04)、(123.70±0.03)ng/ml。在1μg/ml的质量浓度下,相比PBS对照组,806scFv-PE38KDEL对U87MG-EGFRvⅢ、MDA-MB-468、A431和CAL-27细胞增殖的抑制率均显著增高[(98.67±0.07)%vs(2.45±2.85)%、(86.26±1.01)%vs(0.48±1.76)%、(96.72±0.16)%vs(1.33±1.31)%、(96.29±0.30)%vs(2.00±0.60)%,均P0.01],而对U87MG细胞几乎没有抑制作用[(3.59±2.09)%vs(0.19±0.95),P0.05]。结论:本研究所制备的靶向EGFR(287-302)表位的重组免疫毒素806scFv-PE38KDEL能特异地结合并杀伤EGFRvⅢ或EGFR高表达的肿瘤细胞。
【作者单位】： 上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室;
【关键词】： 表皮生长因子受体 隐蔽表位 免疫毒素 单链抗体 铜绿假单胞菌外毒素A 肿瘤
【基金】：上海市科委生物医药重点科技攻关项目资助(No.10431903700) “十二五”国家重大新药创制专项资助(No.2012ZX09103301-005)~~
【分类号】：R392.4
【正文快照】： 重组免疫毒素是利用基因工程技术将具有靶向作用的抗体、配体或细胞因子与毒素相偶联的复合物,又被称为“生物导弹”[1]。目前免疫毒素在肿瘤治疗中得到了广泛的研究和应用,并取得了良好的效果[2-3]。免疫毒素由于毒性很强,因此如何避免或尽量减少免疫毒素上的抗体部分与正常

【参考文献】

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 王华茂;抗EGFRvⅢ单克隆抗体制备及其在肝癌治疗中的应用[D];复旦大学;2009年

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张庆丽;石必枝;蒋华;周敏;王海;孔娟;谢海龙;;EGFRvⅢ特异性单链抗体的制备及其靶向性能[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2011年01期

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 胡素文;悬浮培养重组中国仓鼠卵巢细胞CHO-C12表达抗EGFRvⅢ嵌合抗体C12研究[D];华东理工大学;2011年

2 詹峰;抗GDF15单克隆抗体制备及功能鉴定[D];南京医科大学;2011年

3 杨麟;12H23单抗的嵌合型抗体的生物学活性分析及其模拟表位筛选[D];复旦大学;2010年

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 欧超,吴飞翔,罗元,曹骥,赵荫农,袁卫平,李瑗,苏建家;表皮生长因子受体Ⅲ型突变体在肝细胞癌中的表达及意义[J];癌症;2005年02期

2 徐立;张昌卿;冯凯涛;李锦清;;肝细胞癌及癌旁肝组织EGFR和EGFR vⅢ的表达及其临床意义[J];中山大学学报(医学科学版);2006年04期

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 沈倍奋,黎燕,贺永怀,陈兴,汲言山,赵薇薇,王文香,杨科,藤爱萍,梅巍;免疫毒素用于自体骨髓移植治疗白血病的实验研究及初步临床[J];细胞与分子免疫学杂志;1991年04期

2 辛华雯;;抗宫颈癌细胞株免疫毒素的研究[J];四川生理科学杂志;1991年03期

3 Wawrzynczak E J;张志强;;肿瘤免疫毒素疗法的现状与展望[J];国际肿瘤学杂志;1992年03期

4 王文香，，沈倍奋;重组蓖麻毒素的研究及应用[J];免疫学杂志;1994年03期

5 刘永丰，陆士中;免疫毒素临床应用研究[J];肿瘤;1995年02期

6 林金容,王晓怀,谈立松,潘惠忠;影响免疫毒素杀癌因素初探[J];癌症;1997年03期

7 李斯德;“免疫毒素”一词容易混淆[J];国际免疫学杂志;1989年05期

8 王庆诚;;免疫毒素研究的现状和展望[J];生命的化学;1990年03期

9 褚嘉佑,杨爱德,王辨明,张和君;三种单抗偶联PAP-S制备的免疫毒素对人白血病T淋巴细胞的细胞毒性作用[J];华中科技大学学报(医学版);1991年06期

10 钟为民,戴保民;SOKT_1-RTA免疫毒素的制备及其对人T淋巴细胞的特异性细胞毒作用[J];四川大学学报(医学版);1991年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 汤永民;陈英虎;宁铂涛;沈红强;钱柏芹;;2E8-Gen免疫毒素导向杀伤B系白血病细胞的研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年

2 李卓玉;袁静明;;免疫毒素Geloni-AchRα亚基的基因克隆[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年

3 崔京霞;纪剑飞;吕安国;吴文芳;;定点突变提高IL-4免疫毒素对淋巴瘤的选择性和杀伤活性[A];2005热带亚热带微生物资源的遗传多样性与基因发掘利用研讨会论文集[C];2005年

4 朱进;丁贵鹏;张建平;王子露;许宁;冯振卿;管晓虹;;人源抗MAGE-A1单链抗体的筛选及免疫毒素的特性研究[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年

5 刘新建;张圣海;吴继红;陈霞芳;于惠;黄倩;;免疫毒素腺病毒载体靶向性提高肿瘤基因治疗效果研究[A];第九届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集[C];2006年

6 李卓玉;袁静明;;免疫毒素Gelonin-AchRα亚基的表达,纯化与生物活性　[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年

7 王劲松;王深明;陈国锐;杨大俊;;HELβ1-PE38KDEL和HELβ1-PE33两种重组免疫毒素活性比较[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年

8 王准;胡洪波;崔莲仙;何维;;γδ TCR CDR3嵌合抗体抗肿瘤的初步研究[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

9 王深明;王劲松;李晓曦;陈国锐;杨大俊;;HELβ1-PE38KDEL与常规化疗药物顺铂的协同作用及有关凋亡机制探讨[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年

10 张海忠;汤永民;李思思;沈红强;钱柏芹;罗春芳;张怡;;斑蝥冷盐水浸出液体外杀伤白血病细胞的研究[A];2007年浙江省儿科学、小儿外科学学术年会论文汇编[C];2007年

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1 记者 王雪飞 通讯员 俞莉章;“生物导弹”再抖威风[N];健康报;2000年

2 网讯;我国科学家培育出新型杀瘤细胞[N];医药经济报;2000年

3 储国强 王坤;我国科学家培育出杀灭肿瘤的细胞[N];中国水利报;2000年

4 北京大学泌尿外科研究所教授 俞莉章 北京大学免疫系教授 谢蜀生;生物导弹治疗膀胱癌[N];健康报;2000年

5 李点;杀死袭击人体的叛逆细胞[N];北京科技报;2001年

6 如故;各出奇招擒癌魔[N];中国教育报;2000年

7 余志平;新途径带来新武器[N];医药经济报;2001年

8 记者 谢耕发;2000年中国基础科学研究十大新闻[N];科技日报;2001年

9 本报记者 张强　唐先武 特约记者 肖鑫;浦江劲旅涌春潮[N];科技日报;2009年

10 ;科学的品质[N];中国信息报;2002年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 宋杰;重组毒素rG17PE38的表达、纯化及胃癌杀伤作用研究[D];吉林大学;2013年

2 孙新林;表达重组免疫毒素EphrinAl-PE38的人骨髓间充质干细胞靶向治疗胶质瘤的实验研究[D];南方医科大学;2012年

3 唐U單

本文编号：607107