pH对小鼠肝炎病毒S蛋白构象变化机制的研究

发布时间：2017-08-02 08:03

  本文关键词：pH对小鼠肝炎病毒S蛋白构象变化机制的研究

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【摘要】：冠状病毒是是已知RNA病毒中基因组最大的包膜病毒,在人类、其它哺乳动物类以及鸟类中广泛传播；近十几年来,冠状病毒已经引起两次世界范围内的流行：SARS-CoV和MERS-CoV,死亡率较高,严重威胁人类健康及生命安全。冠状病毒的感染是由刺突蛋白S与受体相互作用介导的,而S蛋白是宿主中和性抗体的主要靶分子,由S1亚基和S2亚基构成,S1负责受体的结合,S2亚基介导病毒包膜与细胞膜之间的融合；一般认为,天然的S蛋白处于一个亚稳定状态,当S1与受体结合之后会发生一系列构象变化,然后S1解离,S2亚基上的膜融合肽暴露插入到细胞膜,随后S2亚基上的两个7肽重复序列形成六螺旋束结构,最终导致膜融合。S2发生的一系列构象变化的机制相对清楚,但S1跟受体结合后是怎样发生构象变化以及构象变化的信号是怎样传递下去并最终介导膜融合的机制是不清楚的。前期的研究表明小鼠肝炎病毒中在pH8.0、没有受体诱导的条件下,S蛋白发生构象变化并高效介导非受体依赖的细胞膜融合(receptor independent syncytia, RIS),并且pH8.0诱导的S蛋白构象变化跟受体诱导的S蛋白构象变化非常类似。因此,这正好为我们研究受体介导的S蛋白发生构象变化提供一个相对简单的研究模型,为进一步阐明冠状病毒感染机制提供了便利的条件。本课题旨在研究没有受体的条件下,pH8.0诱导S蛋白发生的RIS的具体的分子机制。文献报道,组氨酸的pKa值接近中性,是唯一一个pKa值接近中性的氨基酸,在流感病毒中已经证明组氨酸的质子化可以引发HA蛋白的构象变化。因此我们对MHV A59中的所有组氨酸进行了突变,然后研究突变体在pH8.0时是否还能够介导RIS,以此来判断该组氨酸在pH诱导的构象变化中的作用。我们发现S蛋白中179、209、441、643、759位置的组氨酸对pH诱导S蛋白RIS的过程中发挥着重要作用,然后我们进一步研究组氨酸的芳香环结构在pH诱导的S蛋白介导的RIS中的作用,我们将179、209、441、643、759位置的组氨酸突变成苯丙氨酸,发现759位置的芳香环在S蛋白介导的RIS中起着重要作用,但由于苯丙氨酸不受pH影响的特性,我们排除759位置的组氨酸作为pH sensor的可能。综上所述,我们发现MHV A59 S蛋白179、209、441、643位置的组氨酸在pH8.0诱导的RIS中起着关键作用,是主要pH sensor,同时组氨酸芳香环在pH诱导的S蛋白介导的RIS过程中也发挥了一定的作用。
【关键词】：冠状病毒 小鼠肝炎病毒 刺突蛋白 癌胚抗原相关黏附分子
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 第一章 前言9-20
• 1.1 冠状病毒简介9-14
• 1.1.1 冠状病毒的分类9-10
• 1.1.2 冠状病毒的结构10-12
• 1.1.3 冠状病毒的生命周期12-13
• 1.1.4 冠状病毒的流行病学特征及危害13-14
• 1.2 冠状病毒S蛋白的研究进展14-20
• 1.2.1 S蛋白的结构特征及功能14-16
• 1.2.2 S蛋白与受体相互作用关系的研究进展16-17
• 1.2.3 S蛋白诱导膜融合机制的研究进展17-19
• 1.2.4 结语19-20
• 第二章 pH对小鼠肝炎病毒S蛋白构象变化的机制的研究20-52
• 2.1 引言20-23
• 2.2 材料与方法23-40
• 2.2.1 主要试剂及培养基23
• 2.2.2 主要仪器设备23-24
• 2.2.3 主要耗材24
• 2.2.4 菌株、质粒和细胞24
• 2.2.5 常用溶液的配方及配制24-25
• 2.2.6 突变质粒的构建25-29
• 2.2.7 受体蛋白的真核表达29-35
• 2.2.8 细胞转染35
• 2.2.9 western-blot检测冠状病毒S蛋白在细胞内的表达35-36
• 2.2.10 流式细胞仪检测冠状病毒S蛋白在细胞表面的表达36-37
• 2.2.11 MHV假病毒的包装及假病毒颗粒中S蛋白的检测37
• 2.2.12 受体结合实验37-38
• 2.2.13 细胞融合的荧光定量分析38
• 2.2.14 MHV重组病毒的拯救38-40
• 2.3 结果与分析40-50
• 2.3.1 MHV A59野生型S蛋白在有受体或pH8.0没有受体存在的条件下均能发生构象变化40-42
• 2.3.2 组氨酸突变的选择42-43
• 2.3.3 组氨酸突变对S蛋白表达的影响43-44
• 2.3.4 组氨酸突变对S蛋白构象及功能的影响44-45
• 2.3.5 组氨酸突变对受体介导的病毒的入侵的影响45-46
• 2.3.6 组氨酸突变对pH介导的膜融合的影响46-48
• 2.3.7 组氨酸中芳香环的结构对pH介导的细胞融合情况的影响48-50
• 2.4 讨论50-52
• 第三章 全文总结52-53
• 3.1 结论52
• 3.2 研究中的不足及进一步待解决的问题52-53
• 参考文献53-58
• 附录一 MHV S蛋白基因序列58-60
• 附录二 英文缩写词对照表缩略语60-61
• 致谢61-63
• 个人简历及所发表的文章63

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本文编号：608248