Calretinin调节睾丸间质细胞雄激素生成及其机制的研究

发布时间：2017-09-15 22:36

  本文关键词：Calretinin调节睾丸间质细胞雄激素生成及其机制的研究

  更多相关文章： Calretinin 睾丸间质细胞 雄激素 Ca~(2+) 凋亡

【摘要】：研究背景和目的：睾丸主要作用是生成精子和合成雄激素,前者完成于生精小管,后者由睾丸间质细胞(Leydig cells)完成。雄激素的合成和分泌受到下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)的调控。黄体生成激素(LH)结合其受体(LHR),激活环化腺苷酶,将ATP转化为cAMP,激活蛋白激酶A(PKA)通路；激活磷脂酶C(PLC),将磷脂酰肌醇分为二酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3),激活PKC通路。两者促进急性类固醇激素生成急性调节蛋白(STAR)和其它类固醇激素生成酶,促进雄激素的合成。IP3激活肌浆网钙池,细胞质内钙离子增多,与DAG共同作用；Ca2+作为第二信使参与调节雄激素的合成。此外,还受到睾丸局部旁分泌和自分泌调节如胰岛素样生长因子、甲状腺激素、白细胞介素-1(IL-1)、促细胞分裂因子、肿瘤坏死因子(TNF)等。因此,睾丸间质细胞雄激素的合成受到内分泌、自分泌和旁分泌因子的复杂网路的调节。钙视网膜蛋白(calretinin)是一种钙结合蛋白,主要表达于神经系统中,也在卵巢、睾丸中存在。Calretinin主要作用是缓冲细胞内的钙离子(Ca2+)浓度,防止Ca2+超载,也可作为Ca2+感受器发挥作用而Ca2+参与调节雄激素合成。课题组前期研究表明,calretinin在大鼠间质细胞质中表达,且在成年期大鼠间质细胞calretinin表达最高；以间质细胞系为模型,calretinin超表达后,间质细胞睾酮生成增多。提示我们calretinin作为间质细胞内的因子参与调节雄激素合成。综上,我们认为calretinin作为间质细胞内的因子,可影响细胞内Ca2+浓度,通过PKC等通路促进间质细胞雄激素的合成。Calretinin也可以通过促进间质细胞增殖、抑制凋亡作用间接促进睾丸雄激素合成的功能。为验证以上科研假说,本研究以二种睾丸间质细胞系为模型,研究calretinin对间质细胞雄激素合成的作用及其机制。材料与方法：(1)验证本实验室自行构建的LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒,分别转染小鼠间质细胞系(MLTC-1)和大鼠间质细胞系(R2C),通过免疫荧光技术、Western blot方法证明转染病毒表达的有效性；(2)培养MLTC-1、R2C细胞,分别转染LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒载体,体外培养96h,用流式细胞技术检测细胞凋亡；(3)MLTC-1、R2C细胞分别转染LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒载体,Western blot观察增殖及凋亡相关因子：AKT、p-AKT、Bcl2、Bax、cytochromeC、 cleaved-caspase3/9、caspase-3/9、cleaved-PARP、PARP的改变；(4)LV-siRNA-calb2慢病毒载体转染R2C细胞,体外培养96h,放射免疫法测定血清孕酮水平；(5)R2C细胞转染LV-siRNA-calb2慢病毒载体,Western blot方法观察调节间质细胞雄激素合成的PKC信号通路相关蛋白如PLC、p-PKCμ (PKD)、PKD、 p-MARCKS、MARCKS、CREB、STAR的变化；(6)MLTC-1、R2C细胞分别转染LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒载体,并用钙离子探针X-Rhod-1标记细胞内Ca2+,共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+的变化；(7)统计学方法：SPSS17.0软件进行统计学处理,所有数据以均数±标准差(Means计学处)表示,独立样本t检验分析。P0.05代表统计学有显著性差异。结果：(1)LV-calb2慢病毒感染MLTC-1细胞96小时后,与对照组比较,calretinin表达上调2-3倍(p0.001)。LV-siRNA-calb2感染R2C细胞,calretinin表达下降(p0.05),干涉效率达60-70%左右。这表明LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒是高效的。(2)超表达calretinin后,MLTC-1细胞凋亡率减少(p0.001),而干涉calretinin后R2C细胞凋亡率增加(p0.05)。(3)超表达calretinin后,MLTC-1细胞p-AKT、Bcl2/Bax比值增多(P0.05),而cytochromeC、cleaved-caspase3/9、caspase-3/9、cleaved-PARP、PARP表达减少(p0.05),AKT表达不变(p0.05)；干涉calretinin后,R2C表达p-AKT、Bcl2/Bax比值减少,而cytochromeC(p0.05)、 cleaved-caspase3/9、 caspase-3/9、 cleaved-PARP、PARP增多,AKT表达不变。(4)干涉calretinin后,R2C的细胞分泌孕酮减少(p0.05)。(5)干涉calretinin后,PKC通路的信号分子PLC、p-PKD、p-MARCKS、MARCKS、 CREB,STAR表达减少(p0.05),PKD表达不变(p0.05)。(6)超表达calretinin后,细胞内游离Ca2+水平增高(p0.05)；干涉calretinin后细胞内Ca2+水平减少(p0.01)。结论：(1)Calretinin促进睾丸间质细胞类固醇激素的合成。(2)Calretinin作为间质细胞内的因子,通过PLC-Ca2+-PKC信号通路参与调节类固醇激素合成。(3)Calretinin促进间质细胞的增殖,抑制睾丸间质细胞的凋亡,其机制可能是通过加强PI3K-AKT和ERKl/2信号促进细胞增殖,而PI3K-AKT和ERK1/2信号也可抑制线粒体凋亡通路,从而抑制间质细胞的凋亡。提示calretinin对间质细胞的保护性作用,并间接促进睾丸内雄激素的合成。(4)本研究证明calretinin参与调节睾丸雄激素合成及睾丸间质细胞增殖与凋亡,并阐明其作用机制。这对于进一步阐明间质细胞内的分子调节机制具有重要理论意义,对于迟发型性腺功能减退症(LOH)等男性性腺功能减退疾病等具有临床研究与治疗的意义。
【关键词】：Calretinin 睾丸间质细胞 雄激素 Ca~(2+) 凋亡
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R339.2
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-15
• 材料与方法15-25
• 结果25-34
• 讨论34-43
• 结论43-44
• 参考文献44-50
• 文献综述（一）50-60
• 参考文献56-60
• 文献综述（二）60-73
• 参考文献68-73
• 英汉缩略语名词对照73-75
• 攻读硕士学位期间发表文章情况75-76
• 致谢76

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本文编号：859329