针对人NeuroD基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

发布时间：2017-09-29 10:21

  本文关键词：针对人NeuroD基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

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【摘要】：目的构建并鉴定人神经源性分化蛋白基因(NeuroD)RNA干扰慢病毒表达载体。方法根据已公布的NeuroD基因序列(GenBank:NM_002500),设计并合成4对shRNA(NeuroD1~D4),与载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR连接,构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体,转化入感受态细胞DH5α;real-time PCR技术检测pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体对293T细胞内靶基因的干扰效果。将筛选出的干扰载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD1与慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST经酶切后连接,构建慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR。用构建的慢病毒表达载体和包装质粒(Packaging Mix)共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度。采用PCR法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果成功构建针对靶基因的4个干扰质粒,测序结果表明,4个pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体序列与参考序列一致,real-time PCR检测显示以pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD1的沉默效应最佳(P0.01)。将重组获得的慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR转染至293T细胞株,酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期一致,病毒滴度达1.18×108 ifu/mL。结论成功构建、筛选了针对人NeuroD基因的RNA干扰慢病毒表达载体。
【作者单位】： 第二军医大学长海医院病理科;
【关键词】： 慢病毒 NeuroD基因 RNA干扰 胰腺肿瘤
【基金】：国家自然科学基金(30770996,81172310) 长海医院“1255学科建设计划”(CH125521106)~~
【分类号】：R346
【正文快照】： 神经源性分化蛋白(neurogenic differentiation,NeuroD)最早是通过酵母双杂交分析系统克隆出的一个碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)家族成员[1],其基因位于2q32,在神经分化和发育过程中起着重要作用,还参与胰腺的发育和胰岛B细胞的分化[2],是一种含bHLH结构域

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 胡玲;孙崇奎;苟雅萍;李燕;肖丽英;;shRNA慢病毒对人口腔鳞状细胞癌细胞端粒酶卡侯体蛋白1基因的沉默效应[J];国际口腔医学杂志;2013年06期

2 周鹏;高洋;杜红延;李红卫;;慢病毒载体——重组蛋白高效表达的新契机[J];分子诊断与治疗杂志;2013年06期

中国博士学位论文全文数据库 前5条

1 陈玲;RNA干扰α-突触核蛋白基因表达对甲基苯丙胺神经毒性的影响及其机制[D];南方医科大学;2012年

2 张菊;神经干细胞Ankrd17蛋白和MCMV嗜神经蛋白M122相互作用与胎脑发育异常机制[D];华中科技大学;2013年

3 邱阳;WIG-1对人食管鳞癌细胞系顺铂敏感性的影响及其机制研究[D];第三军医大学;2013年

4 马杰;RNA基因干扰技术抑制草鱼呼肠孤病毒复制的研究[D];华中农业大学;2013年

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2 江晨;水稻两个osvdac基因干涉载体的构建及其遗传转化[D];中南民族大学;2011年

3 崔力;抑制瞬时受体电位M7通道表达对人牙髓干细胞增殖、迁移及成骨/成牙向分化的影响[D];南方医科大学;2013年

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【相似文献】

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6 万赤丹;程锐;王春友;王宏博;王帅;刘涛;;解偶联蛋白-2 RNA干扰慢病毒载体的构建[J];中国康复;2008年05期

7 降风;王雪贞;卜碧涛;张苏明;张e，

本文编号：941454