重组人促红细胞生成素对大鼠创伤性脑损伤血管新生的影响及相关机制研究

发布时间：2017-10-24 06:44

  本文关键词：重组人促红细胞生成素对大鼠创伤性脑损伤血管新生的影响及相关机制研究

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【摘要】：创伤性颅脑损伤（Traumatic brain injury, TBI）是导致患者死亡和长期残疾的主要病因之一，按照病理过程包括原发性损伤（Primary brain injury）和继发性损伤（Secondary brain injury, SBI）。原发性颅脑损伤与外界直接作用有关，难以干预。SBI发生于颅脑损伤后数小时至数天，包括线粒体功能的障碍、炎性反应和细胞坏死、凋亡等，最终导致脑缺血、脑梗死、脑水肿等不良预后，是颅脑损伤患者死亡和致残的主要原因。然而，研究发现，约90％的TBI患者有缺血性改变，缺血缺氧又往往伴随出现，所以TBI后的局部缺血缺氧就成为SBI发生、发展的主要机制之一，血管作为供血、供氧的基本结构，血管新生的相关研究就成为科研工作者和临床医师的研究的热点。 血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）作为一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，可以通过与内皮细胞上的两种受体KDR和Flt-1高亲和力结合，一方面直接刺激血管内皮细胞增殖，诱导其迁移和形成官腔样结构；另一方面增加微血管通透性，引起血浆蛋白（主要是纤维蛋白原）外渗，并通过诱导间质产生而促进体内新生血管生成。血小板-内皮细胞粘附分子(Platelet endothelial celladhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)作为血管内皮的重要标记物，对新生血管内皮细胞的标记的特异性很强，并参与血管新生过程，可以有效地反应血管新生的程度。 近年来的研究证实，促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)对脑创伤、脑卒中、缺血等疾病具有保护性治疗作用，但其具体机制尚不清楚。重组人促红细胞生成素（Recombinant human erythropoietin，rhEPO）是一种通过使用重组DNA技术生产的、含有与天然分离的EPO完全相同氨基酸序列的糖蛋白，与天然EPO具有相同的生物学特性。Nakano M等人就曾通过小鼠缺血再灌注损伤模型研究得出EPO诱导VEGF产生，进一步促进血管生成的结论。 我们假设rhEPO的这种促血管形成作用在大鼠TBI模型中同样适用，那么TBI后rhEPO的干预可能会成为一种新的改善脑外伤预后的治疗方法。 第一部分重组人促红细胞生成素对创伤性脑损伤大鼠VEGF分泌及血管新生的影响 目的：通过观察应用促红细胞生成素（rhEPO）对大鼠TBI后，不同时间点挫伤灶及周围脑组织VEGF和CD31的表达变化，探讨rhEPO对TBI后血管新生的影响。 方法：成年健康雄性SD大鼠90只，随机分为对照组（Sham组，n=6只）、颅脑损伤组（TBI组，n=42只）和rhEPO干预组（TBI-rhEPO组，n=42只）。通过改良Feeney法建立颅脑损伤（TBI）模型，按伤后留取标本时间分为TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-5d、TBI-7d、TBI-10d和TBI-14d共7个亚组，每亚组各6只，用正常大鼠作为Sham组，TBI-rhEPO组造模后即刻腹腔注射rhEPO注射液(3000IU/kg)及生理盐水（0.5mg/kg)（用作实验第二部分对照），以后每天同一时间点给药一次，Sham组及TBI组于同一时间点腹腔注射等量生理盐水，直至动物被处死。于预定时间点行神经功能损伤评分（NSS），每亚组随机取三只大鼠处死后取挫伤灶及周围脑组织通过PT-PCR检测VEGF、CD31mRNA表达情况；剩余的3只大鼠采用HE染色观察伤后病灶的病理变化，采用免疫组织化学方法（SP法）检测挫伤灶及周围脑组织中VEGF和CD31蛋白的表达情况，应用显微图像分析系统计算阳性细胞并测定其平均光密度值。 结果：（1）RT-PCR sham组SD大鼠脑组织未检测到VEGF及CD31mRNA明显表达，TBI后挫伤灶及周围脑组织VEGF、CD31mRNA的表达均在TBI-6h开始升高，至TBI-3d表达量达到峰值，随后均呈下降趋势，至TBI-14天表达稍减弱，但仍为高表达状态，而VEGF、CD31mRNA的表达呈正相关(r=0.9239，P0.001），与TBI组比较，TBI-rhEPO组不同时间点大鼠脑组织VEGF及CD31mRNA表达量均明显升高（P0.05）；（2）免疫组化sham组大鼠脑组织未检测到VEGF及CD31蛋白的明显表达，颅脑损伤后挫伤灶及周围脑组织VEGF、CD31蛋白的表达均在TBI-6h开始表达，至TBI-5d至表达高峰，并持续高表达至TBI-10d，至TBI-14d稍下降，但仍处于高表达状态。与TBI组比较，TBI-rhEPO组不同时间点挫伤灶及周围脑组织VEGF和CD31蛋白表达均明显升高（P0.05），且VEGF蛋白表达与CD31蛋白表达呈正相关（r=0.9813，P0.001）；（3）神经功能评分（NSS） sham组SD大鼠NSS评分为0分，颅脑损伤后，TBI-rhEPO组和TBI组NSS评分均随着时间的推移而逐渐下降，但TBI-rhEPO组下降更明显，且在TBI-24h～TBI-14d，TBI-rhEPO组NSS明显低于TBI组，与TBI组比较，差异有统计学意义（P0．05）。 结论：颅脑损伤早期应用rhEPO，可通过上调VEGF和CD31的表达，进而起到对大鼠颅脑损伤的保护作用。注重于血管新生的靶向治疗，可一定程度减轻挫伤灶及周围脑组织缺血缺氧，阻止脑水肿、脑梗死等不良预后的发生发展，达到改善脑外伤预后的目的。 第二部分重组人促红细胞生成素促进创伤性脑损伤大鼠血管新生的相关机制研究 目的：通过观察予以渥曼青霉素(wortmannin)干预的TBI后大鼠损伤灶及周围脑组织中VEGF和CD31的表达变化，探讨rhEPO促进TBI后大鼠血管新生的可能机制。 方法：42只健康雄性SD大鼠通过改良Feeney法建立TBI模型后，即刻腹腔注射重组人促红细胞生成素（rhEPO）注射液（3000IU/kg）及wortmannin（0.5mg/kg)，以后每天同一时间点给药一次，直至动物被处死，记为TBI-WM组，根据伤后处死时间随机分为TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-5d、TBI-7d、TBI-10d和TBI-14d共7个亚组，每亚组各6只。于预定时间点行神经功能损伤评分（NSS），每亚组随机取三只大鼠处死后取挫伤灶及周围脑组织通过PT-PCR检测VEGF、CD31mRNA表达情况；剩余的3只大鼠采用HE染色观察伤后病灶的病理变化，采用免疫组织化学方法（SP法）检测挫伤灶及周围脑组织中VEGF和CD31蛋白的表达情况，应用显微图像分析系统计算阳性细胞并测定其平均光密度值。第一部分实验中TBI组及TBI-rhEPO组作为本部分实验对照组。 结果：（1）RT-PCR TBI-rhEPO组SD大鼠挫伤灶及周围脑组织VEGF、CD31mRNA的表达，在TBI-6h开始升高，，至TBI-3d表达量达到峰值，随后呈下降趋势，至TBI-14d表达稍减弱，但仍为高表达状态；与TBI-rhEPO组比较，TBI-WM组不同时间点大鼠脑组织VEGF及CD31mRNA表达量均明显下降（P0.05）；（2）免疫组化TBI-rhEPO组SD大鼠脑组织VEGF和CD31的表达，在TBI-6h开始表达，TBI-5d表达量达到高峰，高表达持续至TBI-10d，至TBI-14d稍下降，但表达量仍较高，TBI-WM组不同时间点挫伤灶及周围脑组织VEGF和CD31蛋白表达均明显下降（P0.05）；（3）神经功能评分（NSS） TBI-rhEPO组和TBI-WM组NSS均随着时间的推移而逐渐下降，但TBI-rhEPO组下降更明显，且在伤后24h～14d，TBI-rhEPO组NSS明显低于TBI-WM组，与TBI-WM组比较，差异有统计学意义（P0．05）。 结论：rhEPO保护性治疗作用的可能机制是：通过磷脂酰肌醇激酶-3（PI3K/Akt）途径，上调VEGF的表达，促进脑血管新生，从而发挥神经保护作用。
【关键词】：创伤性颅脑损伤 血管新生 促红细胞生成素 渥曼青霉素 磷脂酰肌醇激酶-3 血管内皮生长因子 血小板-内皮细胞粘附分子
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R651.15
【目录】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-14
• 引言14-18
• 参考文献16-18
• 第一部分 重组人促红细胞生成素对创伤性脑损伤大鼠 VEGF 分泌及血管新生的影响18-51
• 1. 实验材料18-20
• 2. 实验方法20-26
• 3. 结果26-40
• 4. 讨论40-46
• 参考文献46-51
• 第二部分 重组人促红细胞生成素促进创伤性脑损伤大鼠血管新生的相关机制研究51-68
• 1. 实验材料51-52
• 2. 实验方法52
• 3. 结果52-62
• 4. 讨论62-65
• 参考文献65-68
• 研究小结68-69
• 综述69-84
• 参考文献79-84
• 中英文缩略词表84-85
• 攻读学位期间发表的论文85-86
• 致谢86-87

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李斌;李建民;吴淑华;朱玉红;商成明;李建华;;脑外伤大鼠脑组织及外周血中ET-1、VEGF表达对脑水肿及微血管变化的影响及意义[J];滨州医学院学报;2012年02期

2 王长卿;王洪生;陈晓峰;赵佩林;;大鼠急性局灶性脑挫裂伤后脑微循环研究[J];中华神经医学杂志;2007年10期

3 王亮;张建宁;;促红细胞生成素与内皮祖细胞在脑损伤中的应用前景[J];国际神经病学神经外科学杂志;2010年05期

4 霍永强;谭源福;;一种改进的落体脑创伤模型[J];广西医科大学学报;2007年02期

5 李曼霞;董志;;脑缺血再灌注时血脑屏障损伤的炎性机制研究进展[J];解放军药学学报;2007年01期

6 谢红志;葛剑;徐海涛;王龙;黄书岚;;大鼠创伤性颅脑损伤后EPO及受体的表达与意义[J];中华神经外科疾病研究杂志;2010年03期

7 张玲玲;魏伟;;BAFF/BAFF-R通过PI3K/Akt/mTOR信号转导通路调节B淋巴细胞功能在类风湿关节炎发病机制中的意义[J];中国药理学通报;2010年07期

8 周薇;胡豫;王华芳;刘练金;王雅丹;郑金娥;魏文宁;;组织因子在大鼠脑微血管血栓形成中的表达[J];中国病理生理杂志;2005年11期

9 沈合春;钱志远;黄胜明;马辉;;rhEPO对大鼠颅脑损伤早期脑微血管内皮细胞紧密连接的保护作用[J];中国临床神经外科杂志;2011年01期

10 Yu Zhang;Li-Ke Yu;Ning Xia;;Evaluation of serum and pleural levels of endostatin and vascular epithelial growth factor in lung cancer patients with pleural effusion[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2012年03期

本文编号：1087565