siRNA抑制转化生长因子-β1对小鼠黄韧带骨化的影响

发布时间：2017-11-25 12:24

  本文关键词：siRNA抑制转化生长因子-β1对小鼠黄韧带骨化的影响

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【摘要】：研究背景： 黄韧带骨化性疾病是一种临床上常见的疾病,许多因素参与其发病过程,例如年龄、种族、基因等；生长因子、应力改变也参与其中。但是目前病因与发病机制未明,与骨的形成有关的生长因子,比如转化生长因子超家族们,他们在黄韧带骨化性疾病的发病过程中扮演着非常重要的作用。国际上已经确认的是TGF-β1、BMP-2参与了韧带骨化的不同时期。然而TGF-β1与BMP-2基因表达的关系及在人脊柱黄韧带骨化进程中的作用,国内外报道很少。 本研究从病因学入手,模拟脊柱韧带骨化的病理生化过程,通过siRNA技术,靶向沉默小鼠黄韧带细胞TGF-β1基因,观察沉默TGF-β1后其对小鼠黄韧带细胞成骨分化的影响,找寻一种高效、专一的阻止脊柱黄韧带骨化的方法,不仅为减小该病的发病率,也为该类疾病的基础研究、临床治疗拓展出一个新的思路。 目的： 运用siRNA技术抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)在已骨化的小鼠黄韧带成纤维细胞中的表达,研究其对小鼠脊柱黄韧带细胞骨化的影响。 方法： 应用外科显微器械取出小鼠胸椎黄韧带成纤维细胞,然后离体培养,借助人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)配制成骨诱导液,诱导细胞向成骨细胞方向分化,对向成骨细胞方向分化的黄韧带细胞,在显微镜下行形态学观察并对其行碱性磷酸酶(ALP)染色与钙化结节茜素红染色；构建靶向TGF-β1基因的siRNA真核表达载体(siRNA-pSilencer2.0U6-TGFβ1)并转染已骨化的细胞,应用免疫荧光技术检测转染前后细胞中TGF-β1、BMP-2的表达;Real-time PCR检测TGF-β1mRNA在细胞内表达变化；Western blotting检测TGF-β1和BMP-2蛋白在细胞内表达变化；酶联免疫吸附试验(ELISA)对细胞中ALP、骨钙素(OC)水平变化进行测定。 结果： 细胞经诱导骨化成功后,对小鼠黄韧带细胞观察及细胞ALP染色、钙结节茜素红染色呈现阳性,具有成骨细胞典型生物学特征。构建的siRNA载体真核质粒对细胞转染后,免疫荧光检测显示TGF-β1和BMP-2荧光强度下降;Real-timePCR检测显示：实验组与阴性对照组及空白对照组比较,TGF-β1mRNA表达分别下降41.94%、47.82%,有统计学差异(P0.01)；Western blotting检测显示：实验组较阴性对照组和空白对照组TGF-β1/β-action蛋白比值表达分别下降35.88%、44.75%,差异有统计学意义(P0.01)；BMP-2/β-action蛋白比值表达分别下降81.79%、86.06%,差异有统计学意义(P0.01)；ELISA检测显示：较阴性对照组和空白对照组,实验组ALP表达分别下降24.14%、32.30%,差异有统计学意义(P0.01)；实验组OC分别下降17.01%、21.63%,差异有统计学意义(P0.01)。 结论： 1.靶向TGF-β1基因的siRNA真核表达质粒能够有效抑制己骨化的成纤维细胞中TGF-β1的表达,间接抑制内源性BMP-2的表达。 2.rhBMP-2诱导黄韧带细胞向成骨细胞方向分化后,早期抑制TGF-β1基因表达可以延缓它的骨化进展。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R686

【参考文献】

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本文编号：1226026