青蒿琥酯对内毒素耐受小鼠的保护作用及其作用机制的初步研究

发布时间：2018-01-12 08:12

本文关键词：青蒿琥酯对内毒素耐受小鼠的保护作用及其作用机制的初步研究　出处：《第三军医大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:脓毒症(sepsis)是由感染因素引起的全身炎症反应综合征(systemic Inflammatory response syndrome,SIRS),脓毒症进一步发展导致的脓毒症休克、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),是临床危重患者死亡的主要原因,病死率高达30%~70%。脓毒症的病理生理表现为炎症风暴(cytokine storm)和免疫抑制(immunosuppression)两个阶段。长期以来,炎症风暴一直被认为是脓毒症的主要特征,因此将脓毒症的研究焦点放在炎症风暴及其造成的MODS,并以此研究脓毒症的防治措施,但是多种以抗炎为目的的治疗策略却均以失败告终。近年来,来自临床的报告显示,虽然脓毒症患者能度过前期的炎症风暴阶段,但是许多却因后期的继发性感染和MODS而死亡,而这与患者处在免疫抑制阶段、机体对病原微生物的二次打击(second hit)抵抗力降低密切相关。单核/吞噬细胞是机体抵抗病原微生物的第一道防线,在识别、清除病原微生物以及抗原的处理、提呈中发挥重要作用。其功能抑制与机体对二次打击抵抗力的降低密切相关。细菌内毒素/脂多糖(endotoxin/lipopolysaccharide,LPS)是诱导脓毒症的主要病原分子。内毒素耐受将导致机体的过度免疫抑制,使机体更易遭受病原微生物的再次攻击。通过建立内毒素耐受模型可模拟临床脓毒症患者免疫抑制状态,为寻找治疗脓毒症有效药物发挥重要作用。抗疟药青蒿琥酯(Artesunate,AS)是含有倍半萜结构的青蒿素衍生物,具有水溶性好、毒性低等优点。我们课题组在前期研究中发现青蒿琥酯具有显著的抗炎作用,基于其抗炎作用我们发现青蒿琥酯对LPS攻击小鼠、热灭活大肠埃希菌(Escherichia coli,EC)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)攻击小鼠、大肠埃希菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)活菌攻击小鼠、盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)脓毒症模型小鼠均具有显著保护作用,该作用可能与其抑制TLR4、TLR9表达,降低LPS水平以及抑制NF-κB活性有关。除具有显著的抗炎作用外,有文献报青蒿琥酯具有免疫调节作用。为研究青蒿琥酯是否可通过其免疫调节作用发挥对脓毒症免疫抑制状态的治疗作用,本课题拟在建立内毒素耐受及二次打击小鼠、细胞模型的基础上,观察青蒿琥酯对内毒素耐受二次打击模型小鼠的保护作用及其可能机制,为寻找有效治疗脓毒症的药物并拓宽青蒿琥酯的临床适应症提供实验依据。方法:一、小鼠内毒素耐受模型的建立与评价1.小鼠内毒素耐受模型的初步建立与评价⑴模型的初步建立:连续5d腹腔注射1mg/kglps后,于第6d尾静脉注射50mg/kglps。⑵模型的评价:通过观察小鼠7d死亡率;血清tnf-α及il-6释放水平;小鼠对大肠埃希菌敏感性变化;小鼠血液中细菌数量的变化评价模型。2.小鼠内毒素耐受模型的优化与评价⑴模型的优化:通过连续腹腔注射不同次数及不同剂量的lps后,再尾静脉注射50mg/kglps,通过观察小鼠体重及状态变化确定最佳耐受模型的建立方案。⑵模型的评价:通过观察小鼠7d死亡率;血清、肺及脾tnf-α、il-6及il-1β释放水平的变化;小鼠对铜绿假单胞菌敏感性变化评价模型。二、青蒿琥酯对内毒素耐受及二次打击模型小鼠的保护作用1.细胞因子检测:采用elisa法测定青蒿琥酯对内毒素耐受模型小鼠血清、肺和脾tnf-α、il-6及il-1β释放的影响。2.死亡率观察:通过统计小鼠7d死亡率,观察青蒿琥酯对内毒素耐受二次打击模型小鼠死亡率的影响。3.细菌清除能力研究:采用平板计数法观察青蒿琥酯对内毒素耐受二次打击模型小鼠血液、肺和脾中细菌数量变化的影响。三、青蒿琥酯对内毒素耐受模型小鼠保护作用机制的初步研究1.体外研究(1)内毒素耐受细胞模型的建立与评价:raw264.7细胞加入5ng/mllps预处理4h后再加入100ng/mllps;采用elisa法检测上清tnf-α及il-6释放水平。(2)细胞因子检测及信号转导分子检测:采用elisa法分别检测青蒿琥酯对内毒素耐受模型细胞释放tnf-α及il-6的影响及其对nf-κbp65及p50活化的影响;采用免疫荧光技术检测青蒿琥酯对内毒素耐受模型细胞tlr4、traf6表达的影响。(3)细菌清除能力研究:内毒素耐受细胞加入5.0×106cfu/ml铜绿假单胞菌建立内毒素耐受二次打击细胞模型;平板计数法观察青蒿琥酯对内毒素耐受二次打击模型细胞细菌数量变化。2.体内研究采用免疫组织化学技术检测青蒿琥酯对内毒素耐受模型小鼠肺和脾中重要信号分子tlr4、traf6蛋白表达及nf-κbp65蛋白活化的影响。结果:一、小鼠内毒素耐受模型的建立与评价1.小鼠内毒素耐受模型的初步建立与评价采用腹腔连续5d注射1mg/kglps并于第6d尾静脉注射50mg/kglps,7d内小鼠全部存活,表明模型建立基本成功;耐受模型小鼠血清tnf-α及il-6水平较50mg/kglps攻击小鼠明显减少;导致耐受小鼠100%死亡的最低大肠埃希菌数量较正常小鼠明显减少;细菌攻击耐受小鼠血液中ec数量较单独细菌攻击小鼠明显增多。2.小鼠内毒素耐受模型的优化与评价⑴腹腔注射0.3、1.0及3.0mg/kglps预处理剂量仅0.3mg/kglps预处理3或5d后小鼠体重及状态基本恢复,因此确定最佳建模方案为:腹腔连续3d注射0.3mg/kglps后于第4d尾静脉注射50mg/kglps。⑵耐受模型小鼠7d内全部存活;耐受模型小鼠血清、肺和脾tnf-α、il-6及il-1β水平较50mg/kglps攻击小鼠明显减少;导致耐受模型小鼠100%死亡的最低铜绿假单胞菌剂量较正常小鼠明显减少。二、青蒿琥酯对内毒素耐受及二次打击模型小鼠的保护作用1.青蒿琥酯呈剂量依赖性地增加内毒素耐受模型小鼠血清、肺和脾中tnf-α、il-6及il-1β的释放。2.青蒿琥酯呈剂量依赖性地降低内毒素耐受二次打击模型小鼠的7d死亡率。3.青蒿琥酯显著减少内毒素耐受二次打击模型小鼠血液、肺和脾中铜绿假单胞菌数量。三、青蒿琥酯对内毒素耐受模型小鼠保护作用机制的初步研究1.体外研究(1)采用5 ng/mL LPS预处理4 h后再用100 ng/mL LPS处理细胞建立内毒素耐受模型,模型细胞TNF-α及IL-6释放较100 ng/mL LPS处理组细胞明显减少。(2)青蒿琥酯呈浓度依赖性地增加内毒素耐受模型细胞TNF-α及IL-6的释放;AS可增加内毒素耐受模型细胞中TLR4、TRAF6蛋白表达及NF-κB p65蛋白活化;(3)青蒿琥酯显著减少内毒素耐受二次打击模型细胞内铜绿假单胞菌数量。2.体内研究青蒿琥酯可增加内毒素耐受模型小鼠肺和脾中TLR4、TRAF6蛋白表达及NF-κB p65蛋白活化。结论:1.采用腹腔连续3 d注射0.3 mg/kg的LPS并于第4 d尾静脉注射50 mg/kg的LPS能成功建立LPS耐受小鼠模型,该模型稳定性好、重复性高,且造模周期最短、药品消耗最少。2.青蒿琥酯可显著提高内毒素耐受模型小鼠致炎细胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β的释放;青蒿琥酯对内毒素耐受二次打击模型小鼠具有显著的保护作用,可提高内毒素耐受二次打击模型小鼠对铜绿假单胞菌的清除能力。3.青蒿琥酯可显著提高内毒素耐受模型细胞致炎细胞因子TNF-α及IL-6的释放;青蒿琥酯可提高内毒素耐受二次打击模型细胞对铜绿假单胞菌的清除能力。4.青蒿琥酯对内毒素耐受二次打击模型小鼠的保护作用机制可能与促进TLR4、TRAF6蛋白表达及NF-кB p65蛋白活化有关。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R459.7

【参考文献】