急性肝衰竭小鼠肠黏膜通透性变化机制及微生态制剂的保护作用

发布时间：2016-10-16 12:39

  本文关键词：急性肝衰竭小鼠肠黏膜通透性变化机制及微生态制剂的保护作用，由笔耕文化传播整理发布。

《河北医科大学》 2014年

急性肝衰竭小鼠肠黏膜通透性变化机制及微生态制剂的保护作用

赵欣  

【摘要】：目的：肝衰竭是指由多种因素引起的严重肝脏损害，导致肝脏本身合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，临床上出现以凝血机制障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组症候群[1]。关于肝衰竭的发病机理目前尚不十分清楚。近年来，多数学者认为本病的发生主要是免疫损伤，缺血缺氧，内毒素血症三重致死性打击的结果[2]。肝衰竭时存在严重的内毒素血症，内毒素及其下游产物肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6、NO等炎性细胞因子的异常升高，一方面可以导致大量肝细胞坏死或凋亡，亦能通过某种机制影响或是破坏了肠黏膜屏障功能，导致肠黏膜通透性增高，从而使得一些大分子物质、细菌及其毒素均可以随意通过肠黏膜屏障，并且与自发性细菌性腹膜炎、肝性脑病等严重并发症的发生密切相关。因此本实验拟通过对BALB/c小鼠腹腔注射D-氨基半乳糖建立急性肝衰竭小鼠（acute liverfailure，ALF）模型，并应用微生态制剂—双歧杆菌乳杆菌三联活菌（金双歧）灌胃干预，研究急性肝衰竭小鼠回肠ZO-1蛋白表达情况及其与血清TNF-α、血浆内毒素水平等的关系，以探讨ALF肠黏膜通透性升高的可能机制以及微生态制剂的保护作用。 方法：选用健康清洁级6-8周龄雄性BALB/c小鼠30只，体重18-22g。30只小鼠采用随机数字表法分成正常对照组、急性肝衰竭组和金双歧干预组（简称干预组），每组各10只。所有小鼠均标准饲料喂养，饲养温度18-22℃，相对湿度(60.0±10.0)％。正常对照组及急性肝衰竭组小鼠给予生理盐水（9ml/kg/d）灌胃，干预组给予双歧杆菌乳杆菌三联活菌（900mg/kg/d，生理盐水配成100mg/ml混悬液）灌胃，每日一次，两周后急性肝衰竭组和干预组一次性腹腔注射D-氨基半乳糖（3.0g/kg，以生理盐水溶解，浓度为60mg/ml），正常对照组腹腔注射等体积生理盐水。注射后9h以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，摘眼球法处死小鼠，留取血清、血浆、肝组织及回肠组织。应用日本OLYMPUS AU-2700全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT），天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）；酶联免疫吸附法检测血清TNF-α水平；应用鲎试剂显色基质法测定血浆内毒素水平；取部分肝组织固定于10%福尔马林溶液，石蜡包埋，4μm连续切片并进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察肝组织的普通病理学改变；实时荧光定量聚合酶链反应（real time quantitative polymerase chainreaction，RT-qPCR）检测肝组织TNF-α mRNA及回肠组织ZO-1mRNA的表达；Western blot检测回肠ZO-1蛋白的表达。采用SPSS21.0统计软件对数据进行分析。实验数据以均数±标准差（x±s）表示。数据分析前进行正态性及方差齐性检验。满足正态且方差齐时，采用单因素方差分析，组间比较采用Student-Newman-Keuls法。非正态或方差不齐时，采用Kruskal-Wallis H秩和检验，组间比较采用Mann-Whitney U检验。相关性分析采用Pearson直线相关分析法。P 0.05为差异有统计学意义。 结果： 1小鼠的一般情况 正常对照组小鼠毛发有光泽，精神状态好，饮食量多，对外界刺激反应灵敏；急性肝衰竭组小鼠毛发凌乱没有光泽，饮食量明显减少，活动减少，对外界刺激反应迟钝；干预组小鼠上述表现介于正常对照组与急性肝衰竭组之间。 2肝组织病理学变化 HE染色示：正常对照组：肝小叶结构清晰，以中央静脉为轴，肝细胞索呈放射状排列，肝细胞结构完整，大小均匀，无变性及坏死，无炎细胞浸润；急性肝衰竭组：肝小叶结构紊乱，肝细胞索消失，，可见多处出血坏死灶，并有大量炎细胞浸润；干预组：肝小叶结构基本完整，细胞排列较整齐，仅见轻度细胞水肿，小叶中央区仅有少量点状坏死，变性、坏死及炎性细胞浸润的程度均较急性肝衰竭组显著改善。 3各组小鼠血清ALT、AST、TNF-α及血浆内毒素水平变化 急性肝衰竭组小鼠血清ALT （393.587±31.010）、 AST（475.751±41.536）、TNF-α（435.971±30.415）及血浆内毒素（3.789±0.313）水平均高于正常对照组（38.994±9.628、55.279±7.500、51.602±8.540、0.577±0.120），差异具有统计学意义（P值均0.01）；干预组上述各指标（158.271±23.637、259.216±22.492、256.289±26.221、2.716±0.214）均较急性肝衰竭组明显下降，差异具有统计学意义（P值均0.01）。 4肝组织TNF-α mRNA及回肠组织ZO-1mRNA表达变化 急性肝衰竭组小鼠肝组织TNF-α mRNA表达（3.355±0.274）明显高于正常对照组（1.00），差异具有统计学意义（P0.01）；并且，干预组小鼠肝组织TNF-α mRNA表达（2.284±0.212）较急性肝衰竭组明显下降，差异具有统计学意义（P0.01）。 急性肝衰竭组小鼠回肠ZO-1mRNA表达（0.441±0.046）明显低于正常对照组（1.00），差异具有统计学意义（P0.01）；干预组小鼠回肠ZO-1mRNA表达（0.680±0.039）较急性肝衰竭组明显升高，差异具有统计学意义（P0.01）。 5回肠组织ZO-1蛋白水平 急性肝衰竭组小鼠回肠ZO-1蛋白表达（0.361±0.037）明显低于正常对照组（0.808±0.069），差异具有统计学意义（P0.01）；干预组小鼠回肠ZO-1蛋白表达（0.552±0.055）较急性肝衰竭组明显增加，差异具有统计学意义（P0.01）。 6ZO-1蛋白与血清TNF-α、血浆内毒素水平的相关性分析 各组小鼠回肠ZO-1蛋白的表达与血清TNF-α、血浆内毒素水平均呈负相关，相关系数分别为r=-0.946，-0.919（P值均0.01）。 结论： 1腹腔注射D-氨基半乳糖能够成功建立急性肝衰竭小鼠模型，血清TNF-α和血浆内毒素在其发生发展中发挥不可或缺的作用。 2急性肝衰竭小鼠回肠ZO-1mRNA/蛋白表达较正常对照组明显下降，且ZO-1蛋白的表达量与血清TNF-α水平之间存在相关性，TNF-α通过抑制回肠ZO-1mRNA的表达进而下调ZO-1蛋白的表达，破坏肠黏膜上皮细胞间的紧密连接，可能是TNF-α导致肠黏膜通透性升高的原因之一。 3微生态制剂改善肠黏膜通透性的可能机制之一是通过降低循环中内毒素含量、降低TNF-α水平从而上调回肠ZO-1蛋白的表达实现的。 4微生态制剂可以补充肠道的正常菌群，改善肠道菌群失调，减少内毒素、TNF-α的合成与释放，减轻内毒素对肝脏的损害而发挥保肝作用。

【关键词】：
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.3
【目录】：

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