烧伤后皮肤组织修复再生的基础与临床研究（汗腺再生及烧伤后化脓性肉芽肿诊疗）

发布时间：2018-02-01 23:36

  本文关键词： 外分泌汗腺 自发荧光 骨髓间充质干细胞 分化 甲基化 烧伤 化脓性肉芽肿　出处：《中国人民解放军医学院》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：1.探索人外分泌汗腺的自发荧光发生机制；2.筛选与人骨髓间充质干细胞(MSCs)转分化为汗腺样细胞过程密切相关基因启动子位点,探索DNA甲基化调控MSCs的转分化机制；3.回顾分析烧伤后化脓性肉芽肿病例特点,比较烧伤后化脓性肉芽肿与经典化脓性肉芽肿的不同,优化烧伤后化脓性肉芽肿的诊断和治疗技术。方法：1.全厚皮肤组织样本来自5例志愿者,用荧光显微镜观察人皮肤组织石蜡切片HE染色后外分泌汗腺自发荧光,并与间接免疫荧光方法比较；提取外分泌汗腺,置于荧光显微镜镜下观察自发荧光,采用激光共聚焦扫描显微镜测量贴壁后汗腺自发荧光强度。2.热休克汗腺诱导MSCs共培养10d,间接免疫荧光技术检测MSCs转分化后KRT19和CEA标志，用RT-PCR和Western blo ts检测诱导MSCs分化0d、5d和10d后CEA基因和蛋白表达情况。芯片检测MSCs分化前后45万个基因位点DNA甲基化水平变化。从甲基化水平显著变化基因位点中,筛选出与MSCs转分化密切相关基因位点。用飞行质谱技术检测关键基因启动子的甲基化水平在诱导分化前后的水平变化；筛选出的关键基因构建质粒并转染MSCs并培养,分为三组,D组Pax6转染组用MSCs培养基,E组未转染MSCs培养基内加入10ng/μL5-Azd,F组Pax6转染MSCs培养基内加入10ng/μL5-Azd。应用RT-PCR和Western blot检测转染5天CEA基因和蛋白表达。3.收集2003年至2013年烧伤后化脓性肉芽肿患者诊治资料,纳入标准为资料完整,并且随访时间大于6个月。排除标准为资料不完整,或随访时间不足6个月或者失访。结果：1.HE染色后切片存在自发荧光现象,在蓝光(470/40 nm)下呈现绿色荧光,在绿光(515-560 m)下呈现红色荧光,在紫外光(340-380 nm)下呈现蓝色荧光。这种自发荧光与间接法免疫荧光比较具有不衰减、操作简单和成本低的特点；游离外分泌汗腺自发荧光在蓝光(430-500)下表现为绿色,在绿光(500-560nm)下表现为红色,在紫外光(小于430nm)下表现为蓝色,488nm激光激发光谱分析有两个峰值。一个峰值位于530nm,荧光强度为11.54±4.66；另一个位于590nm,荧光强度为10.38±4.33。2.MSC经共培养10d后KRT19和和CEA免疫荧光染色示阳性,对照组KRT19和CEA示阴性。芯片检测MSC诱导分化前后共有76个基因位点的DNA甲基化水平具有明显差异(0.169%o),甲基化水平明显降低51个位点,其中SLC12A7、ENKUR、LRWD1、Pax6和HDAC4等位点甲基化水平显著下降。甲基化水平明显升高25个位点,其中Hoxd11、 ADARB2、ANGPT1、UNC84A和BMP6等位点DNA甲基化水平明显升高。提示MSC转分化过程中DNA甲基化水平以下调为主。经过比较分析,选择Pax6基因位点进行飞行质谱检测,结果提示该位点甲基化水平明显降低。质粒构建Pax6转染MSCs,培养5天仅F组CEA基因表达明显增高,CEA蛋白阳性表达。3.本研究纳入共15例患者，男女比例为10：5。年龄范围自1岁到58岁,均曾有Ⅱ度烧伤。分布于面颈部、躯干和四肢等。保守治疗和手术治疗均能治愈PGB。保守治疗需要43.9±8.65天,手术治疗患者住院时间21±2.74天，两者相比较P0.01。11例患者创面培养细菌或者真菌阳性。10例保守治疗自愈。3例全层切除,其中2例切除植皮,1例切除直接缝合。2例刮除手术。14例患者无复发,仅1例刮除手术后7天复发,经创面换药后自愈。结论：1.外分泌汗腺自发荧光具有不衰减的特点,是一种观察外分泌汗腺结构的简单方法,这种自发荧光和外分泌汗腺贴壁后的自发荧光可能来源于黄素和脂褐素。2.DNA去甲基化在MSCs分化过程中起到重要的调控作用,Pax6基因与5-Azd协同作用可能调控CEA基因表达影响MSC转分化；3.PGB与经典化脓性肉芽肿不同,其发病可能与感染有关,诊断依赖于病史、临床特点和病理组织检测,宜首选保守治疗方法。
[Abstract]:Objective : 1 . To explore the mechanism of spontaneous fluorescence of human excrete sweat gland and to explore the mechanism of expression of CEA gene and protein after the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) into sweat gland - like cells . Conclusion : 1 . The level of methylation of DNA demethylation is significantly lower than that of classical pyogenic granuloma . The results suggest that the expression of DNA methylation is reduced significantly in the course of differentiation of MSCs .

【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R644
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本文编号：1483137