重组ADAMTS13对脑出血后脑损伤和脑水肿的作用机制研究

发布时间：2018-02-16 03:23

  本文关键词： 脑出血 血管性血友病因子 ADAMTS13 中性粒细胞 小胶质细胞 组织纤溶酶原激活剂激活剂　出处：《复旦大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景：脑中风又称为脑卒中,是世界三大致死性和致残性疾病之一。脑中风分为缺血性脑中风和出血性脑中风,其中缺血性脑中风约占所有脑中风的80%,出血性脑中风主要分为蛛网膜下腔出血和脑出血,脑出血约占所有脑中风的15%,尽管脑出血在所有脑中风中所占比例不高,但是脑出血在所有脑中风疾病中的死亡率居首位。tPA是目前唯一被美国国家食品药品监督管理局(FDA)批准用于急性缺血性脑中风的药物,但是tPA治疗后易引起溶栓性脑出血。tPA引起的溶栓性脑出血机制尚未被阐明,但是有文献报道tPA通过破坏血脑屏障引起脑出血。血管性血友病因子(von Willebrand factor vWF)是一种结构复杂的糖蛋白,在凝血和血栓中起重要作用,另外在炎症反应系统中VWF作为炎症介质能够通过促进炎症细胞的粘附、聚集进而促进炎症反应。有文献报道VWF基因敲除能够减少脑缺血后脑梗死体积。另外基础和临床研究表明蛛网膜下腔出血后血液中的vWF表达明显上调,vEF参与介导蛛网膜下腔出血后脑梗死和血管痉挛的发生,vWF高表达会导致脑出血病人预后不良。ADAMTS13是vWF切割酶,vWF是目前已知ADAMTS13的唯一底物,ADAMTS13通过切割超聚化、功能超强的vWF使之成为分子量较小、活性较低的多肽,减少血栓形成和炎症反应,减少脑缺血和蛛网膜下腔出血后神经功能损伤。本实验采用MCAO和ICH两种脑中风模型,检测这两种动物模型对血浆vWF表达量的影响,并进一步探讨vWF切割酶rADAMTS13对tPA引起的急性脑中风后溶栓性脑出血和脑出血后脑损伤和脑水肿的影响。实验方法：课题整体分成两个部分,第一部分：重组ADAMTS13对脑出血后脑损伤和脑水肿的作用机制研究；第二部分：重组ADAMTS13通过vWF减少脑缺血后tPA引起的脑出血。第一部分实验方法：1.本实验采用二次注血法在小鼠纹状体中注入30μL自体血构建小鼠脑出血模型。2.用ELISA方法测定脑出血24h后血液中vWF水平变化情况。3.用HE染色法测定脑出血72h后脑损伤体积。4用干湿重法测定脑出血72h后脑组织含水量。5.用fluoro-jade B染色法检测出血24h后血肿周边神经元变性情况。6.注射Evans blue观察脑出血24h后血脑屏障通透。7.用ELISA检测脑出血24h后IL-6表达情况。8.用MPO活性测定法测定MPO活性9.用免疫荧光技术测定脑出血24h后中性粒细胞浸润、小胶质细胞激活情况。10.用Western Blot测定脑出血24h后ICAM-1, VCAM-1表达情况。11.用明胶酶谱法测定脑出血后24h后MMP-9的活性。第二部分实验方法： 1.本实验采用小鼠单侧大脑中动脉阻塞的方法(MCAO)建立局灶性缺血/再灌注模型。2.首先我们使用ELISA法检测缺血造模后给予tPA导致的小鼠血浆vWF水平变化情况。3.用紫外分光光度计测定不同处理组(vehicle、tPA、vWF、tPA+vWF、tPA+rATS、tPA+vWF+rATS)的脑出血量。4.采用明胶酶谱法分析不同处理组(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA) MMP-9活性变化情况.5.应用Western Blot方法检测不同处理组(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA)细胞核内NF-κB表达情况6.用Western Blot方法测定不同处理组(sham、vehicle、 tPA、rATS+tPA) VEGF表达水平,利用免疫荧光法测定不同处理组(vehicle、 tPA、rATS+tPA) VEGF与CD31+的共标数量。7.利用Western Blot技术测定不同处理组(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA) RhoA激活的水平,通过免疫荧光计数不同组(vehicle、tPA、rATS+tPA) RhoA-GFAP共标细胞的数量。实验结果：第一部分实验结果：1.脑出血24h后血浆中的vWF水平比Sham组有明显升高。2.重组ADAMTS13减少脑出血后脑损伤、脑水肿和神经元变性。3.重组ADAMTS13减少脑出血后血脑屏障破坏。4.重组ADAMTS13能够降低脑出血后IL-6表达水平。5.重组ADAMTS13能够抑制脑出血后MPO活性上调。6.重组ADAMTS13减少脑出血周边区域中性粒细胞浸润和小胶质细胞激活。7.重组ADAMTS13减少炎症细胞间粘结蛋白ICAM-1的表达。8.重组ADAMTS13可以减少脑出血后脑组织中的MMP-9活性。第二部分实验结果：1.小鼠缺血后给予tPA会导致血浆vWF水平上调。2.缺血造模后单独给予vWF都会导致出血量增多,tPA共同给药并没有比单独给予tPA或者vWF导致更多出血,提示tPA可能在同一条通路上引起缺血后脑出血；rATS和tPA共同给药发现rATS可以显著减少tPA引起的脑出血,而vWF则可以够逆转rATS对tPA引起脑出血的作用。3.明胶酶谱法分析发现tPA组相比于vehicle组MMP-9活性上调,rATS能抑制tPA引起的MMP-9活性上调。4. Western Blot实验结果表明rATS+tPA组与tPA组相比,细胞核中NF-kB的水平没有显著性差异。5.Western Blot实验结果表明缺血后tPA使VEGF表达明显上调,rATS能抑制tPA引起的VEGF表达上调；免疫染色结果显示缺血24h后VEGF主要与CD31阳性的血管共定位,tPA组与vehicle组相比,梗死周围区域VEGF与CD31免疫共标量显著增加,rATS+tPA组与tPA组相比共标量下降。6.Western blot分析表明脑缺血能够激活RhoA, tPA给药后RhoA的激活量进一步增加,而rATS能够减少tPA引起的RhoA激活；免疫荧光法计数梗死24h后缺血周边区RhoA-GFAP共标细胞的数量,rATS+tPA组与tPA组相比RhoA阳性星形胶质细胞数量显著减少。结论：1.脑出血导致血浆vWF表达上调,重组ADAMTS13通过下调炎症介质、降低MMP-9活性、减少中性粒细胞细胞浸润和小胶质细胞激活从而减少血脑屏障损伤,最终减轻脑损伤和脑水肿。2.tPA通过vWF通路调节缺血后脑出血,rADAMTS13通过作用于vWF减少缺血后tPA治疗引起的溶栓后脑出血。rADAMTS13通过下调VEGF表达、减少RhoA激活、抑制MMP-9活性最终减轻tPA引起的缺血溶栓后出血。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R651.15

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本文编号：1514545