脉冲直流电场诱导表皮细胞电趋性的作用研究

发布时间：2018-02-21 16:05

本文关键词： 脉冲直流电持续直流电电趋性场强脉宽频率表皮细胞电化学反应　出处：《第三军医大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景自19世纪发现人体生理电场以来,从细胞实验到在体实验,人们对电场诱导细胞迁移、促进创面愈合的作用进行了大量研究。研究发现,正常皮肤表皮或上皮组织细胞间能够维持定向的离子流动,从而形成纵向电位差;当皮肤或上皮组织的完整性受到破坏、形成创面时,该电位差在创面处迅速短路,使电流从正常组织区域流向创面,形成电场方向指向创面的横向电场,这即是创面内源性电场。近年研究显示,创面内源性电场是指导表皮细胞定向迁移的关键因素,而后者是创面愈合的前题基础。体外实验发现,表皮细胞能在外加持续直流电场下产生定向迁移,该现象称为表皮细胞的电趋性。目前,国内外多数研究均采用持续直流电场作为刺激因素研究细胞的电趋性及其机制。然而,持续直流电场长时间作用将不可避免导致热效应和电解效应等电刺激副作用,使得持续直流电场的在体应用受到限制、现有研究与临床应用脱轨。我们前期发现,处于持续直流电场环境中的成纤维细胞去掉电场作用后,其电趋性并不会立即消失,而在一定时间内仍表现出较强的定向迁移特性,提示细胞的电趋性诱导或维持并不需要持续的电刺激,进而我们推测脉冲直流电可能同样具有诱导细胞电趋性的作用。脉冲直流电场(PDCEF)是一种间断作用的直流电场,具有场强(EF)、频率(f)和脉宽(D)三个可变参数。与持续直流电场(CDCEF)相比,PDCEF能通过调节脉宽进而调节电场的作用时间;若低脉宽的脉冲直流电能诱导细胞电趋性,那么无疑将显著减少电场对细胞的作用时间,减轻电场的热效应和电解效应,从而有可能为临床应用电场促进创面愈合提供新的技术方法。本研究旨在探讨不同参数条件下PDCEF对表皮细胞电趋性的诱导作用;通过与相同场强的CDCEF比较,评估PDCEF诱导表皮细胞电趋性的效能与副作用,为临床应用PDCEF促进创面愈合奠定实验基础。材料与方法1、乳鼠原代表皮细胞的分离、培养与细胞电趋性实验模型的建立取出生1-3天的balb/c乳鼠全层皮肤,用dispaseⅡ溶液4°c孵育过夜;次日分离表皮,将其剪碎后用0.25%胰酶消化约5min,血清终止消化,反复吹打后过滤、离心;调整细胞密度至1x103后将细胞接种于细胞爬片,置于37°c、5%co2孵箱中培养待用。将构建的电趋性小室模型浸泡于75%的酒精中30min,然后置于超净台紫外灯下照射30min。将接种有表皮细胞的细胞爬片置入电趋性小室,在电趋性小室两侧加细胞培养基各2ml,使电趋性小室中充满培养基;常规构筑外加电场装置,将构建好的细胞电趋性实验模型置于活细胞工作站,实时动态观察细胞在电场作用下的迁移运动。2、脉冲直流电场诱导表皮细胞电趋性的作用和特性分析1)选取一定参数的pdcef(ef=150mv/mm,d=60%,f=0.1hz)作用表皮细胞3h,imagej软件分析表皮细胞运动的方向性和速度,明确pdcef是否具有表皮细胞电趋性诱导作用。2)固定pdcef频率为0.1hz、脉宽为60%,观察场强变化(0-200mv/mm)对表皮细胞电趋性的影响。3)固定pdcef频率为0.1hz、场强为150mv/mm,观察脉宽变化(0-100%)对表皮细胞电趋性的影响。由于脉宽为100%的pdcef实质上为cdcef,因此上述实验可用于对比分析相同场强作用条件下pdcef和cdcef诱导表皮细胞电趋性的差异。4)固定pdcef场强为150mv/mm、脉宽为60%,观察频率(0.001-5000000hz)变化对细胞电趋性的影响。3、脉冲和持续直流电场诱导表皮细胞电趋性和介导电化学副反应的对比研究1)在场强(50-250mv/mm)相同的条件下,对比分析不同脉宽(20-80%)的pdcef(频率为0.1hz)和cdcef(脉宽为100%的pdcef)诱导表皮细胞电趋性的差异。2)分析在场强(50-250mv/mm)相同的条件下,当不同脉宽(40-80%)的pdcef(频率为0.1hz)实际作用于细胞的电刺激时间与cdcef相同时表皮细胞电趋性差异。3)在相同场强(ef=150mv/mm)作用条件下,对比分析pdcef和cdcef对电趋性模型中溶液或细胞培养基ph值和mv值变化的影响,明确pdcef和cdcef介导电化学副反应差异。结果1、乳鼠原代表皮细胞培养与细胞电趋性实验模型建立原代小鼠表皮细胞接种培养4h左右开始贴壁、伸展,细胞轮廓清晰,呈圆形或椭圆形,可见伪足伸展,折光性好,生长旺盛。构建的电趋性实验装置可用于活细胞工作站下实时动态观察细胞的迁移运动;电场持续作用3h,电趋性小室两侧电压波动小,表明实验装置具有良好的稳定性。2、脉冲直流电场诱导表皮细胞电趋性的特性分析1)在3h的观察时间内,无电场作用的表皮细胞呈现随机运动(方向性:-0.09±0.05);而pdcef(ef=150mv/mm,d=60%,f=0.1hz)作用的表皮细胞呈现明显的向电场阴极迁移运动(方向性:0.76±0.04),同时在x轴方向上的运动速度显著增高。时效分析显示,施加pdcef30分钟内,表皮细胞即表现出向电场阴极定向迁移的特性,且运动速度增加。2)在固定频率(0.1hz)和脉宽(60%)的条件下,pdcef诱导表皮细胞电趋性的特性与场强呈正相关;场强越高,表皮细胞的电趋性越好,表现为细胞运动的方向性和速度增加。场强为50mv/mm时,表皮细胞向电场阴极迁移的方向性为0.35±0.05,提示该条件下pdcef诱导表皮细胞电趋性的阈值电压在50mv/mm以下。3)在固定频率(0.1hz)和场强(150mv/mm)的条件下,pdcef诱导表皮细胞电趋性的特性与脉宽呈正相关;脉宽越大,表皮细胞的电趋性越好。脉宽为20%时,表皮细胞向电场阴极迁移的方向性为0.26±0.05,提示该条件下pdcef诱导表皮细胞电趋性的阈值脉宽为20%左右。当脉宽达到或大于60%时,表皮细胞向阴极迁移的方向性增加不再显著,与100%的脉宽(实质为持续直流电场)比较无显著差异。4)在固定场强(150mv/mm)和脉宽(60%)的条件下,0.001-1000hz之内的频率变化对pdcef诱导的表皮细胞电趋性无显著影响;当频率达到5000000hz时,表皮细胞的电趋性显著下降。3、脉冲和持续直流电场诱导表皮细胞电趋性和电化学副反应的对比研究1)在场强相同的条件下,达到一定阈值脉宽的pdcef(频率为0.1hz)均能诱导与cdcef等效的电趋性。场强为50mv/mm时,pdcef达到与cdcef等效电趋性的阈值脉宽为80%;场强为150mv/mm时,pdcef达到与cdcef等效电趋性的阈值脉宽为60%;场强为250mv/mm时,pdcef达到与cdcef等效电趋性的阈值脉宽为40%。2)在场强相同的条件下,当PDCEF(频率为0.1Hz)实际作用于细胞的电刺激时间与CDCEF相同时,PDCEF较之CDCEF能以更短的实际电刺激时间诱导表皮细胞电趋性。场强为50、150和250mV/mm时,PDCEF诱导表皮细胞出现电趋性的时间分别为30min、15min和15min;而CDCEF诱导表皮细胞电趋性出现的时间分别为45min,45min和30min,提示间断电刺激能增强表皮细胞的电趋性反应。3)在场强相同的条件下,PDCEF所导致的细胞培养基或缓冲液p H和m V值改变显著小于CDCEF,且随时间的增加,这一趋势越明显。结论1、PDCEF具有诱导表皮细胞电趋性的重要作用,其电趋性诱导效应呈场强、作用时间、脉宽和频率依赖性。2、在场强相同的条件下,达到或超过阈值脉宽的PDCEF具有与CDCEF等效的电趋性诱导作用,且场强越大,所需的阈值脉宽越低。3、在实际电场作用时间与CDCEF相同的条件下,PDCEF能在一定程度上增强表皮细胞的电趋性反应。4、PDCEF对电趋性实验装置中细胞培养基或缓冲液的电化学副反应显著低于CDCEF。5、较之CDCEF,适当参数的PDCEF更适合作为新的电刺激技术用于临床促进创面愈合。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R641

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