钙蛋白酶在严重烧伤大鼠骨骼肌消耗中的作用及机制研究

发布时间：2018-02-24 13:23

本文关键词： 钙蛋白酶烧伤骨骼肌消耗凋亡蛋白降解　出处：《中国人民解放军医学院》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：严重烧伤后机体处于物质能量高分解代谢状态，作为人体最大氮库的骨骼肌是受分解代谢影响最大的器官，致伤后极长的一段时间内骨骼肌会陷入严重的消耗状态。骨骼肌严重消耗将导致机体免疫力下降，感染率增加等，严重影响患者的生存质量和预后。我们实验室既往研究表明，严重烧伤后骨骼肌消耗主要源于泛素-蛋白酶体活化引发的肌原纤维蛋白降解增加。然而，泛素-蛋白酶体途径不能直接降解肌原纤维蛋白，而有赖于钙蛋白酶（calcium-activated neutralprotease，calpain）等其它途径作用产生可被泛素-蛋白酶体降解的蛋白。钙蛋白酶是细胞内依赖钙的中性半胱氨酸酶，通过Ca2+激活进而表现出蛋白水解酶活性。新近研究表明，钙蛋白酶在许多高代谢病理状态引发的骨骼肌消耗中起着重要作用。为进一步阐明严重烧伤后骨骼肌消耗的机制，为临床治疗提供实验依据，本研究拟通过严重烧伤动物模型和体外细胞实验探讨：（1）严重烧伤大鼠骨骼肌消耗、骨骼肌超微结构及钙蛋白酶活性变化规律；（2）钙蛋白酶活化导致严重烧伤大鼠骨骼肌消耗的作用机制；（3）严重烧伤后大鼠骨骼肌钙蛋白酶活化的原因；（4）钙离子泵抑制剂丹曲林对严重烧伤后骨骼肌消耗的影响及初步机制。方法：第一部分（动物实验）雄性Wistar大鼠80只（180~210g），随机分为假烫组（n=40）和烫伤组（n=40），背部浸入94℃热水12s、腹部6s制备50%体表面积（total body area surface，TBSA）III度烫伤动物模型。于伤后0d、1d、4d、7d、14d（n=8）五个观察点，采集腹主动脉血和骨骼肌标本。采用大鼠体重、大鼠肌肉重量/体重比评估烫伤大鼠骨骼肌消耗情况；透射电镜观察骨骼肌超微结构变化；实时定量荧光PCR检测calpain-1及calpain-2表达水平；Western blot免疫印迹检测胫骨前肌中calpain-1、calpain-2蛋白表达水平；荧光定量检测钙蛋白酶活性。第二部分（动物实验）雄性Wistar大鼠72只随机分为3组，假烫组（n=24）、烫伤组（n=24）和抑制剂组（n=24）。烫伤组和抑制剂组制备50%TBSAIII度烫伤。伤后抑制剂组采用腹腔注射MDL28170（钙蛋白酶抑制剂，24mg/kg）给药，1/24h。假烫组和烫伤组大鼠给予等量溶液（2%DMSO的林格氏液）。伤后1d、7d、14d（n=8）三个观察点采集胫骨前肌标本。采用大鼠体重、大鼠肌肉重量/体重比评估烫伤大鼠骨骼肌消耗情况；定量检测胫骨前肌中游离肌丝含量；SDS-PAGE分析游离肌丝中肌动蛋白、肌球蛋白和肌联蛋白的含量；荧光定量检测骨骼肌中钙蛋白酶、26S蛋白酶体及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3活性；原位末端转移酶标记（Tunel）染色检测肌组织细胞凋亡；Western blot免疫印迹分析胫骨前肌中calpain-1、calpain-2、肌动蛋白、肌球蛋白以及蛋白酶体C2亚基蛋白表达水平，胞浆和线粒体中活化Bid（truncated Bid，tBid）、细胞色素c（Cytochrome c，Cyt c）、calpain-2蛋白含量，以及蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、糖原合成酶-3β（(glycogensynthesis kinase，GSK-3β）和叉形头转录因子3a（Forkhead box O3a，FoxO3a）总蛋白和磷酸化蛋白水平。（细胞实验）体外培养的大鼠骨骼肌L6细胞分为对照组、calpain-2过表达组、calpain-2过表达+抑制剂组。对照组采用含有终浓度为5mM CaCL2的完全培养基培养；calpain-2过表达组细胞转染pGMLV-calpain-2-PA1慢病毒3d后，用含有终浓度为5mM CaCL2的完全培养基培养；calpain-2过表达+抑制剂组细胞转染慢病毒3d后，用含有5mM CaCL2和10nM MDL28170的完全培养基培养。培养0h、6h和24h后收集细胞，AnnexinV/PI染色流式检测细胞凋亡情况；荧光定量检测L6细胞中caspase-3活性；Western blot免疫印迹分析胞浆和线粒体中tBid、细胞色素c、calpain-2蛋白含量。第三部分（动物实验）雄性Wistar大鼠80只随机分为假烫组（n=40）和烫伤组（50%TBSAⅢ°烫伤，n=40)。伤后0d、1d、4d、7d、14d五个观察点（n=8），采集胫骨前肌标本。电子探针X射线显微分析法检测骨骼肌细胞胞浆、线粒体、肌浆网三微区内Ca2+含量；实时定量荧光PCR检测胫骨前肌中钙蛋白酶激活蛋白和钙蛋白酶抑制蛋白（calpastin) mRNA水平；Western blot免疫印迹分析calpastin蛋白表达；荧光定量检测骨骼肌中钙蛋白酶活性。（细胞实验） L6细胞分为对照组和实验组两组，对照组细胞用含有10%假伤大鼠血清的DMEM培养基孵育、实验组细胞用含10%烫伤大鼠血清的DMEM培养基孵育。孵育0h、6h、24h、48h后，Fluo4-AM检测细胞胞浆中Ca2+浓度，荧光定量检测L6细胞中钙蛋白酶活性。第四部分（动物实验）雄性Wistar大鼠56只随机分为假烫组（n=8）、烫伤组（50%TBSAⅢ°烫伤，n=24）和丹曲林组（50%TBSAⅢ°烫伤，n=24）。伤后假烫组、烫伤组尾静脉注射5%甘露醇，丹曲林组尾静脉注射丹曲林钠2mg/kg（溶于5%甘露醇），伤后1d、4d、7d三个观察点采集胫骨前肌标本，称量体重及骨骼肌重量。透射电镜观察骨骼肌超微结构变化；电子探针X射线显微分析法检测骨骼肌细胞三微区内Ca2+含量；Western blot免疫印迹分析胫骨前肌中calpain-1、calpain-2蛋白表达；荧光定量检测骨骼肌中钙蛋白酶活性。结果：第一部分：（1）50%TBSAIII度烫伤后大鼠体重以及胫骨前肌（快肌）重量明显降低，烫伤组胫骨前肌/体重比明显低于假烫组（P0.05），伤后7d最为显著；（2）伤后烫伤组骨骼肌肌原纤维出现溶解、断裂、Z线局部消失，并伴有线粒体肿胀和空泡化现象，与肌组织损伤动态变化基本一致；（3）伤后烫伤组大鼠胫骨前肌calpain-1和calpain-2蛋白及mRNA表达水平均升高，其中蛋白水平于伤后4d达到峰值；（4）伤后钙蛋白酶的活性持续上升，于伤后7d达到峰值。第二部分：（1）烫伤后大鼠胫骨前肌游离肌丝明显增加，肌动蛋白、肌球蛋白和肌联蛋白含量显著增加，钙蛋白酶活性升高，伤后7d达到极值。应用钙蛋白酶抑制剂后胫骨前肌游离肌丝未见明显增加，肌动蛋白、肌球蛋白和肌联蛋白含量显著低于烫伤组，钙蛋白酶活性一直处于较低水平；（2）严重烫伤后胫骨前肌中26S蛋白酶体活性及C2亚基蛋白表达升高，显著高于假烫组。加入钙蛋白酶抑制剂后，26S蛋白酶体活性及C2亚基蛋白表达与同时间点烫伤组相比明显下降；（3）烫伤组骨骼肌Tunel核凋亡指数、caspase-3活性显著高于假烫组，伤后7d差异最为显著，给予钙蛋白酶抑制剂后，肌组织细胞凋亡指数、caspase-3活性明显低于烫伤组。烫伤组和抑制剂组胫骨前肌胞浆和线粒体中calpain-2蛋白表达均显著升高，但同时间点抑制剂组蛋白表达低于烫伤组；伤后各组胞浆中Bid蛋白表达差异不显著，但线粒体中tBid蛋白表达存在显著差异，伤后1d、7d烫伤组线粒体中tBid蛋白表达显著升高，抑制剂组tBid蛋白表达明显低于烫伤组；细胞色素c蛋白在假烫组和抑制剂组胫骨前肌胞浆中表达较少，烫伤后随时间延长烫伤组胞浆中细胞色素c蛋白含量显著升高，伤后7d烫伤组胞浆中细胞色素c含量显著高于假烫组和抑制剂组，同时线粒体中细胞色素c含量明显减少，伤后7d烫伤组线粒体中细胞色素c含量显著低于假烫组和抑制剂组。体外细胞实验中calpain-2过表达的L6细胞凋亡率和caspase-3活性显著升高，与对照组差异显著，抑制剂组细胞凋亡率和caspase-3活性略有升高，但低于过表达组。过表达组和抑制剂组胞浆中calpain-2蛋白表达没有显著差异，但过表达组细胞线粒体内calpain-2随着孵育时间的增加而升高，显著高于抑制剂组；L6细胞线粒体及胞浆内tBid含量与calpain-2蛋白的变化趋势相似。过表达组L6细胞线粒体中细胞色素c蛋白含量逐渐降低，胞浆中细胞色素c蛋白的逐渐升高，24h后达到极值。抑制剂组中细胞胞浆及线粒体中细胞色素c蛋白变化趋势同过表达组，但两组存在显著差异；(4)严重烧伤后胫骨前肌中Akt、mTOR、GSK-3β和FoxO3a蛋白的磷酸化水平显著降低，给予钙蛋白酶抑制剂后，伤后1d和7d的Akt、mTOR、GSK-3β蛋白磷酸化水平显著高于烫伤组。第三部分：（1）烫伤组大鼠伤后胫骨前肌细胞浆、线粒体Ca2+升高，肌浆网Ca2+含量降低，，伤后1d Ca2+变化达到极值。烫伤组calpastatin mRNA表达水平呈现先降低后升高的趋势，伤后1d和4d的calpastatin mRNA水平明显低于假烫组，烫伤组calpain activator的mRNA伤后略有变化，与假烫组没有显著差异。伤后胫骨前肌中calapastatin蛋白表达下降，伤后4d显著低于假烫组；（2）烫伤血清孵育L6细胞引起胞浆内Ca2+含量升高，随着孵育时间延长，Ca2+含量增加，钙蛋白酶活性升高。第四部分：（1）钙通道RyR受体阻滞剂丹曲林明显抑制细胞胞浆及线粒体内Ca2+超载，丹曲林组伤后1d、4d细胞胞浆、线粒体内Ca2+含量明显低于烫伤组；（2）丹曲林组伤后肌组织超微结构与对照组相比未见明显变化；（3）calpain-1和calpain-2蛋白表达水平显著低于烫伤组；（4）丹曲林组钙蛋白酶的活性虽有略有波动，但仍显著低于烫伤组。丹曲林治疗有效降低骨骼肌消耗，缓解烧伤导致的体重及胫骨前肌/体重比变化。结论：（1）严重烧伤后钙蛋白酶活化是严重烧伤后骨骼肌消耗的重要原因。活化的钙蛋白酶可通过裂解肌原纤维、释放游离肌丝、上调下游泛素-蛋白酶体途径的活性，启动和加速蛋白降解；活化的钙蛋白酶激活线粒体凋亡途径促进细胞凋亡；同时钙蛋白酶还通过抑制Akt活性及其信号通路下游分子磷酸化，抑制蛋白合成、促进骨骼肌消耗。（3）细胞内持续Ca2+超载及钙蛋白酶抑制蛋白低表达是严重烫伤后骨骼肌胞浆内的钙蛋白酶活化的主要原因。（4）钙蛋白酶抑制剂（MDL28170）和钙通道RyR受体阻滞剂（丹曲林）能减轻烧伤引起的骨骼肌消耗，为指导临床治疗严重烧伤骨骼肌消耗提供理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R644

【参考文献】