HBV相关慢加急性肝衰竭患者表观遗传学变化研究

发布时间：2018-02-25 08:55

  本文关键词： 乙型肝炎病毒 慢加急性肝衰竭 表观遗传 单卵孪生子 DNA甲基化 基因印迹 小分子RNA　出处：《第三军医大学》2013年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：在我国,慢性HBV感染是引起慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)的主要病因。ACLF病情凶险,进展迅速,预后较差,虽然近年来在ACLF的治疗等方面取得了很大的进展,但病死率仍高达50%～60%。这与ACLF发病机制尚不明确直接相关,故明确其发病机制对提高ACLF的治疗水平具有重要意义。我们前期对感染HBV的单卵孪生子(monozygotic twins, MZ twins)临床观察发现,同样感染HBV,MZ孪生子间表现出完全不同的临床表型。MZ孪生子相当于天然的“克隆人”,共享遗传背景,排除了DNA序列差异对基因表达的影响,其HBV感染途径一致,但表现出明显不同的表型,考虑可能主要是由于表观遗传学修饰机制所致。近年研究发现DNA甲基化、小分子RNA (microRNAs, miRNAs)和基因印迹等表观遗传调控机制广泛参与了病毒复制、炎症和免疫调节等过程。故我们推测表观遗传调控机制在HBV感染后ACLF的发病中可能起重要作用。 了解DNA甲基化、miRNAs和基因印迹等表观遗传调控机制在ACLF患者与对照样本之间差异表达有助于筛选出与ACLF相关的表观遗传现象,为进一步阐明表观遗传调控在ACLF发病中的具体机制奠定基础。所以我们以HBV感染后表型分别为ACLF和无症状携带者(asymptomatic carrier, AsC)的一对MZ孪生子标本为基础,采用以下方法观察了ACLF和AsC患者间DNA甲基化、基因印迹和miRNAs表达的差异。以期了解表观遗传调控与ACLF的关系。 方法： 1.采用Agilent Human CpG Islands arrays芯片对MZ孪生子进行了全基因组差异甲基化芯片扫描,获得HBV感染后表型不同MZ孪生子间差异甲基化基因谱。通过Roche Nimblegen表达谱芯片进行全基因组表达扫描,获得HBV感染后表型不同MZ孪生子间差异表达基因谱。联合分析甲基化基因的表达和基因已知功能筛选出可能与ACLF发病相关的甲基化基因。 2.通过表达谱芯片结果筛选出MZ孪生子间差异表达印迹基因,并采用荧光定量RT-PCR在52例HBV感染后ACLF患者和48例AsC患者间验证差异表达情况。然后采用PCR—限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析筛选IGF2基因杂合标本；并用基于RT-PCR的RFLP分析检测杂合标本的印迹状态。采用χ2检验分析印迹基因IGF2在ACLF患者和AsC患者印迹状态差异。 3.采用Exiqon miRNA Array芯片完成孪生子间差异1niRNA表达谱扫描,获得差异表达miRNA谱。并采用荧光定量RT-PCR在104例HBV感染后ACLF患者和96例AsC患者间验证表达差异。Targetscan、iRanda和PicTar数据库多重比对等方法预测差异表达miRNA靶基因。 主要研究结果： 1.在ACLF MZ孪生子有47条基因特异性甲基化且表达下调或无表达；有88条基因特异性非甲基化且表达上调,其中28条基因仅在ACLF MZ孪生子有表达。这些差异表达基因与炎症信号通路,炎症介质表达,微循环障碍等密切相关。生物信息学分析发现以下7条基因的异常甲基化可能与肝炎发病相关：ZEB1、USP47、BTF3L4、 ADCYAP1、 PLCH2、F10和PAK6。 2.发现ACLF MZ孪生子中上调印迹基因13条：DDC、TFPI2、KLF14、ABCA1、 IGF2、IGF2AS、KCNQ1DN、CDKN1C、SLC22A18AS、MEG3、DLK1、 ATP10A及TCEB3C;下调印迹基因8条：SGCE、PEG10、DLX5、SNRPN、MKRN3、MAGEL2. NNAT及L3MBTL2。可能与肝脏炎症相关的IGF2、DKN1C和TFPI2均在ACLF患者表达增高(P0.001)。IGF2在ACLF患者发生基因印迹缺失(loss of imprinting, LOI)较AsC患者明显增加(55.56%vs.21.05%,P=0.045)。 3.在MZ孪生子间发现差异表达miRNA53条；45条在ACLF MZ表达上调,8条表达下调。hsa-let-7a、hsa-mir-16在ACLF患者表达明显增高,分别增高8.58和8.63倍(P0.001)。靶基因预测结果发现BCL2、CARD8、EDA、IL1RAPL1、LTB及FZD10可能为hsa-mir-16参与ACLF发病的靶基因；CERCAM、IGF2BP1、OPRM1及MAP4K3可能为hsa-let-7a参与ACLF发病的靶基因。 结论： 1.HBV感染后ACLF患者与AsC患者间存在基因差异甲基化、印迹基因和miRNAs表达差异等表观遗传漂移现象。证实表观遗传调控可能参与了ACLF的发生。 2.IGF2在ACLF患者表达较AsC患者明显增加,其原因与IGF2在ACLF患者发生基因印迹缺失的比例增加有关。 3.let-7a、mir-16在ACLF患者表达明显增高。mir-16可能通过调节BCL2、ARD8等的表达；let-7a可能通过调节IGF2BP1、MAP4K3等的表达参与肝脏炎症的发生。
[Abstract]:In our country, chronic HBV infection is caused by acute on chronic liver failure (acute-on-chronic liver failure, ACLF.ACLF) the main cause of serious disease, rapid progression, poor prognosis, although in recent years in the treatment of ACLF made great progress, but the mortality rate is still as high as 50% ~ 60%. and the pathogenesis of ACLF is not so clear is directly related to clarify its pathogenesis has important significance to improve the treatment level of ACLF. Our previous child of HBV infected monozygotic twins (monozygotic twins, MZ twins) clinical observation found that the same HBV infection, MZ twins showed different clinical phenotypes of.MZ twins is equivalent to the natural "human cloning, shared genetic background, excluding the impact of DNA sequence differences in gene expression, the same way the HBV infection, but showed significantly different phenotypes, consideration is likely due to epigenetic Due to recent studies indicate that DNA methylation, small molecule RNA (microRNAs, miRNAs) and gene imprinting mechanisms of epigenetic regulation is involved in a wide range of viral replication, inflammation and immune regulation process. So we speculate that the incidence table epigenetic regulation mechanism of ACLF in HBV after infection could play an important role.
Understanding of DNA methylation, miRNAs and gene imprinting mechanisms of epigenetic regulation in the sample differences between ACLF patients and control the expression of help in the selection of ACLF related epigenetic phenomena, lay the foundation for further understanding the specific mechanism of epigenetic regulation in the pathogenesis of ACLF. So we use HBV phenotype after infection respectively ACLF and asymptomatic carriers (asymptomatic carrier, AsC MZ) a pair of twins were observed based on ACLF and AsC between patients with DNA methylation by using the following methods differentially expressed gene imprinting and miRNAs. In order to understand the relationship between epigenetic regulation and ACLF.
Method锛，

本文编号：1533768